脯氨酸羟化酶3在心肌细胞调亡中的作用及机理

本论文在其他论文栏目，由论文格式网整理,转载请注明来源www.lwgsw.com,更多论文,请点论文格式范文查看目的：凋亡对多细胞动物的胚胎发育和成年组织的稳态维持过程起着重要作用，凋亡的失调可导致多种疾病，如癌症、动脉狭窄、神经退行性病变等。在心血管系统，心肌病、心肌缺血再灌注和充血性心衰等疾病的发生发展也与凋亡密切相关。脯氨酸羟化酶（PHDs）是一类双加氧酶，它利用氧作为底物，生成羟化的脯氨酸残基。它在哺乳动物细胞中有三种亚型（PHD1， PHD2 ，PHD3）。有研究表明，在这些凋亡相关的心血管疾病的组织中，PHD3的表达上调。据此，我们推测PHD3与心肌细胞凋亡相关。本研究的目的就是要证明PHD3是否在心肌细胞凋亡中有直接作用；如果有，研究其作用机理。
方法：我们选取阿霉素处理的H9c2大鼠胚胎心肌细胞株作为心肌细胞凋亡模型，通过细胞活力实验（MTT）、线粒体膜电位（ΔΨm）和caspase-3活性这几个指标来验证凋亡的发生和程度。通过PHD3 overexpress和 knockdown稳转H9c2细胞株来验证PHD3在凋亡过程中的调控作用。通过应用PHD羟化活性抑制剂和PHD3失去酶活性的突变来验证其在调亡过程的调控作用是否依赖其羟化酶活性。用免疫印迹、细胞转染后免疫共沉淀和荧光共振能量转移（FRET）的方法来研究PHD3调节凋亡过程的机制。
结果：阿霉素处理的H9c2细胞24小时后细胞活力和线粒体膜电位下降，caspase-3活性增加，与此同时PHD3表达增加。与H9c2细胞相比，PHD3 overexpress的稳转细胞株在阿霉素处理后，细胞活力和线粒体膜电位更低，caspase-3活性更高；而PHD3 knockdown稳转细胞株则与PHD3 overexpress稳转细胞株结果相反。PHD3抑制剂或失去酶活性突变的应用结果与PHD3 knockdown类似。免疫共沉淀结果显示PHD3能与Bcl-2家族中的Bcl-2共沉淀，而不与Bcl-xL、Mcl-1或Bax共沉淀。荧光共振能量转移实验结果显示PHD3-CFP与Bcl-2-YFP之间的FRET效率与阳性对照无差别。Bcl-2缺失BH4结构域得突变（Bcl-2△BH4）不能PHD3共沉淀，而单独的Bcl-2的BH4结构域（Bcl-2-BH4）仍可与PHD3共沉淀。与H9c2细胞相比，在PHD3 overexpress稳转细胞株的Bcl-2沉淀物中Bax的量较少。
结论：实验结果表明PHD3可促进心肌细胞的凋亡，这种促进作用是羟化酶活性依赖的，并且是通过与Bcl-2的BH4结构域的相互作用，进而降低了Bax- Bcl-2复合物的形成实现的。这一发现提示我们可以通过干预PHD3来提高心脏疾病中的心肌细胞的存活能力或者降低阿霉素作为抗肿瘤药物的心脏毒性作用。