聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）

摘要：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。本试验采用连续PAGE法分离LDH及其同工酶，并掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
关键字：聚丙烯酰胺凝胶电泳、乳酸脱氢酶同工酶、分离

 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
 
 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续法和不连续法两种。从凝胶形式上可分为柱式和板式。装凝胶柱于直立的玻璃管中进行电泳分离，成为柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存，板式电泳的优点是能在同一凝胶板上、同一操作条件下，同时比较多个样品，还可作双向电泳，便于利用各种测定方法，尤其便于进行放射自显影操作。
 聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，除去一般电泳的电荷效应以外，还有两种物理效应：1. 凝胶对样品的筛选效应：颗粒小、呈球形的样品分子移动快，颗粒大的、形状不规则的分子通过凝胶空洞时的阻力大，移动慢。2. 不连续系统对样品的浓缩效应：由于柱式不连续体系的四个不连续性，导致样品的在电泳开始时就得到浓缩，然后分离。不连续电泳系统所具备的电荷效应、分子筛选效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。
 
 乳酸脱氢酶(1actatedehytrogenase．LDH)及其同工酶(isoenzyme)是糖代谢中的一种很重要的酶，它催化丙酮酸与乳酸的相互转化。
  
  LDH是发现最早又研究最多的具有同工酶的一组酶，由于同工酶的分子结构不同，电泳迁移率不同，因此电泳法可将其分开。在哺乳动物中，LDH是由两种亚基(H亚基和M亚基)通过不同的组合形成四聚体，共有五种同工酶，LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。这些同工酶在不同器官中的分布及含量不同，各器官都有自己特定的同工酶谱。如心肌中LDHl活性最高，肝脏中LDH5活性最高。正常情况下，血清中LDH同工酶活性较低，多半来自红细胞的渗出和释放，经电泳分离，可呈现特定的同工酶谱。
 LDH同工酶经提纯后可分为5条区带，从阳极到阴极的顺序依次为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。他们均具有LDH催化活性，是一种LDH同工酶。它是由H亚基和M亚基按不同比例组成的四聚体，广泛的分布于动物的各种组织以及微生物和植物中。这种同工酶通过不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法可被分离。若通过连续聚丙烯酰胺凝胶电泳则只会出现带状条纹，不会分离。
 
 本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳连续法，观察肝、心、脑、肌、血清5种组织中同工酶的含量，若采用不连续法则可以是这些物质中的同工酶得到分离。

试剂及器材

材料
动物未溶血新鲜血清，动物组织提取液（组织重量与组织云将缓冲液体积比为1：5或1：10）

1.2 试剂
1.2.1 PAGE有关试剂
     凝胶贮液、电极缓冲液、AP溶液
1.2.2 LDH同工酶染色贮存液
 5mg/mL氧化性辅酶1溶液
 1mol/L乳酸钠溶液
 0.1mol/L氯化钠溶液
 1mg/mLPMS溶液
 1mg/mL氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液
 0.5mol/L pH=7.5磷酸盐缓冲液
1.2.3 制备组织匀浆缓冲液：0.01mol/L pH=6.5磷酸盐缓冲液

1.3 器材
 稳压、稳流电泳仪，垂直板电泳槽（微型），移液管，移液枪，烧杯，培养皿，恒温水浴，凝胶成象仪。

1.4 步骤

1.4.1. 凝胶配置

试剂名称 配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml 配制10ml浓缩胶所需试剂用量
 5% 7.5% 10% 15% 3%
分离胶贮液 3.33 5.00 6.66   
分离胶缓冲液 2.50 2.50 2.50 2.50 
1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 1.00
混匀后，置真空干燥器中，抽气10min
10% 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05

1.4.2. 灌胶
 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液。注满后，立即在分离胶溶液中插入干净的梳子，小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。浓缩胶聚合完成后，小心溢出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。如凝胶底部两玻璃板之间有气泡，必须设法排出。

1.4.3. 预电泳
 为防止LDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物的影响，引起酶的钝化或其他人为效应，再加样前，应进行预电泳，电泳条件20mA，0.5h，关闭电源后准备加样。

1.4.4. 加样
 取10—20μl血清或组织匀浆，加体积40%蔗糖混匀后，用移液枪吸取20—30μl样品，小心加在凹形样品槽内。

1.4.5. 电泳
 加样后打开电源，将电流调至10mA，待样品进入分离胶后，改为20—25mA，当溴酚蓝前沿距离橡胶眶下缘1-20cm时，将电流调为0，关闭电源。

1.4.6. 染色脱色与制干板
贮存液 NAD 乳酸钠 NaCl NBT PMS 磷酸缓冲液
用量/ml 4.0 2.5 2.5 10.0 1.0 5.0
 电泳结束后，取下凝胶膜，刮下硅橡胶框，撬开玻璃板，在凝胶右下角切出一小角作为标记，小心取出凝胶板，将其放在盛有染色液的培养皿中，置37度水浴中保温15-30min，待LDH同工酶呈现蓝紫色区带，即可用蒸馏水洗去染色剂，加入脱色液终止酶反应并使底色脱净，用凝胶成像仪拍照。
 
试验结果

结果讨论
 根据以上试验结果，可以看出在肝、心肌、脑、骨骼肌、血清5种组织中同工酶中，同工酶LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5的含量有所不同，心肌中一LDH1含量最高，骨骼肌及肝中的LDH5最高。

本试验的影响因素以及做好试验的关键是：
制胶时应注意不能产生起气泡。插入梳子时应倾斜插入，以免产生气泡
电泳时电流不要太高，应防止热效应引起LDH失活，电泳应在冰浴中进行。
LDH同工酶活性染色时间不要太长，一般以15—30min为宜，当大多数条带均呈蓝紫色时即可中止染色。
电泳后应迅速拨胶，防止色带扩散。
所用器材必须清洁。特别是制备凝胶柱所用的玻璃管每次用后必须用洗液浸泡，再常规清洗，否则凝胶剥离困难。
电泳完毕后，上下槽电极缓冲液不可混合，因离子强度和pH值都已发生改变。
丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，应避免直接接触。
 
 
同工酶的染色原理：
 将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的同工酶凝胶条，加上酶的底物乳酸，则可催化底物脱氢生成丙酮酸。同时生成还原型NADH+H+，它可使吩嗪硫酸甲酯(PMS)还原，后者又使浅黄色的氯化硝基四氮唑蓝(NBT)还原成蓝紫色，从而显示各同工酶区带。其反应式如下：
 
 反应产生的蓝紫色即还原型NBT含量与酶活力成正比，可直接观察颜色的深浅进行分析，也可将染色的胶条用光密度扫描仪进行扫描，根据波峰计算出各同工酶的百分含量。
 

LDH同工酶的应用现状：
 LDH同工酶的分离及测定在临床上有重要意义。正常情况下，血清中LDH同工酶活性较低，电泳呈现其特定的同工酶谱。当某组织受损时，该组织中的LDH可释放到血液中，使血清 LDH的总活性升高，但酶的总活性升高幅度不一定与有关脏器(如心或肝等)的病损程度相一致，故测定酶的总活性对患病器官的鉴别意义不大。但LDH同工酶在不同器官组织中的分布及含量不同，有关的器官组织发生损伤时，可反映在同工酶谱的变化上，故测定LDH同工酶可有助于受损部位的鉴别诊断。如肝脏疾患时，血清中LDH；升高；而在心肌受损时，血清中 LDH，升高，因此电泳分离同工酶，经光密度扫描仪扫描，测出各同工酶的百分含量，不但提高了诊断的灵敏度，而且对病变器官的鉴别也有重要意义。
 此项测定目前常用于诊断心肌梗塞，肝病和某些恶性肿瘤。在诊断心肌梗塞时虽然活性增高的时间比 CK要迟，阳性率也较低，但持续时间较CK长。
1．心肌疾病：心肌梗塞时LDH增高，心肌梗塞发病后8-10小时开始上升，2-3天达高峰，持续1－2周恢复正常。若LDH增高后恢复迟缓，或在病程中再次升高者，提示梗塞范围扩大，预后不良。
2．肝脏疾病：急性肝炎或慢性肝炎活动期LDH常显著或中度增高，其灵敏度低于ALT，肝癌时LDH活性明显增高，尤其转移性肝癌时LDH活性增高更明显。
3．血液病：白血病、贫血、恶性淋巴瘤等LDH活性增高。
4．其它：肌营养不良、横纹肌损伤、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也增高。
由于LDH存在于很多组织中，其总活性测定不能特异地反映某一组织或器官的情况，为了进一步了解某一器官的病变，可测定LDH同工酶有助于区别不同组织来源。
 人血清中含有五种LDH同工酶，它们是由H(心肌型)和M[骨焰肌型)两类亚基组成的不均一的五种四聚体。按其在琼脂电泳中泳动的快慢，由正极向负极依次为LDHl、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。心脏、脑、红细胞等富含LDHl和LDH2，而肝脏及骨铬肌则含LDH4和LDH5最多。因此测定LDH同工醇有助于病变器官的定位。

参考文献：
① 刘箭   生物化学实验教程   科学出版社
② 韦和平   生物化学实验与指导   中国医药科学出版社