摘要:同工酶是指能催化同一种化学反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶,方法简便,灵敏度高,重现性强,测定结果便于观察、记录和保存。本试验采用连续PAGE法分离LDH及其同工酶,并掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识,熟悉主要的操作过程,同时对同工酶有一个感性的认识。 关键字:聚丙烯酰胺凝胶电泳、乳酸脱氢酶同工酶、分离
带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动,这种现象称为电泳。近几十年来,电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快,在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子,有较高的分辨率,目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体(Acrylamide,简写为Acr)和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺(N,N'-Methylena Bisacrylamide,简写为Bis)在催化剂的作用下聚合而成的。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续法和不连续法两种。从凝胶形式上可分为柱式和板式。装凝胶柱于直立的玻璃管中进行电泳分离,成为柱式电泳,此法制备凝胶方便,样品需要量少,凝胶条便于长期保存,板式电泳的优点是能在同一凝胶板上、同一操作条件下,同时比较多个样品,还可作双向电泳,便于利用各种测定方法,尤其便于进行放射自显影操作。 聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中,除去一般电泳的电荷效应以外,还有两种物理效应:1. 凝胶对样品的筛选效应:颗粒小、呈球形的样品分子移动快,颗粒大的、形状不规则的分子通过凝胶空洞时的阻力大,移动慢。2. 不连续系统对样品的浓缩效应:由于柱式不连续体系的四个不连续性,导致样品的在电泳开始时就得到浓缩,然后分离。不连续电泳系统所具备的电荷效应、分子筛选效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。 乳酸脱氢酶(1actatedehytrogenase.LDH)及其同工酶(isoenzyme)是糖代谢中的一种很重要的酶,它催化丙酮酸与乳酸的相互转化。 LDH是发现最早又研究最多的具有同工酶的一组酶,由于同工酶的分子结构不同,电泳迁移率不同,因此电泳法可将其分开。在哺乳动物中,LDH是由两种亚基(H亚基和M亚基)通过不同的组合形成四聚体,共有五种同工酶,LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。这些同工酶在不同器官中的分布及含量不同,各器官都有自己特定的同工酶谱。如心肌中LDHl活性最高,肝脏中LDH5活性最高。正常情况下,血清中LDH同工酶活性较低,多半来自红细胞的渗出和释放,经电泳分离,可呈现特定的同工酶谱。 LDH同工酶经提纯后可分为5条区带,从阳极到阴极的顺序依次为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。他们均具有LDH催化活性,是一种LDH同工酶。它是由H亚基和M亚基按不同比例组成的四聚体,广泛的分布于动物的各种组织以及微生物和植物中。这种同工酶通过不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法可被分离。若通过连续聚丙烯酰胺凝胶电泳则只会出现带状条纹,不会分离。 本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳连续法,观察肝、心、脑、肌、血清5种组织中同工酶的含量,若采用不连续法则可以是这些物质中的同工酶得到分离。
试剂及器材
材料 动物未溶血新鲜血清,动物组织提取液(组织重量与组织云将缓冲液体积比为1:5或1:10)
1.2 试剂 1.2.1 PAGE有关试剂 凝胶贮液、电极缓冲液、AP溶液 1.2.2 LDH同工酶染色贮存液 5mg/mL氧化性辅酶1溶液 1mol/L乳酸钠溶液 0.1mol/L氯化钠溶液 1mg/mLPMS溶液 1mg/mL氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液 0.5mol/L pH=7.5磷酸盐缓冲液 1.2.3 制备组织匀浆缓冲液:0.01mol/L pH=6.5磷酸盐缓冲液
1.3 器材 稳压、稳流电泳仪,垂直板电泳槽(微型),移液管,移液枪,烧杯,培养皿,恒温水浴,凝胶成象仪。
1.4 步骤
1.4.1. 凝胶配置
试剂名称 配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml 配制10ml浓缩胶所需试剂用量 5% 7.5% 10% 15% 3% 分离胶贮液 3.33 5.00 6.66 分离胶缓冲液 2.50 2.50 2.50 2.50 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 1.00 混匀后,置真空干燥器中,抽气10min 10% 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05
1.4.2. 灌胶 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液。注满后,立即在分离胶溶液中插入干净的梳子,小心避免混入气泡,再加入浓缩胶溶液以充满梳子间的空隙,将凝胶垂直放置于室温下。浓缩胶聚合完成后,小心溢出梳子。把凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。如凝胶底部两玻璃板之间有气泡,必须设法排出。
1.4.3. 预电泳 为防止LDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物的影响,引起酶的钝化或其他人为效应,再加样前,应进行预电泳,电泳条件20mA,0.5h,关闭电源后准备加样。
1.4.4. 加样 取10—20μl血清或组织匀浆,加体积40%蔗糖混匀后,用移液枪吸取20—30μl样品,小心加在凹形样品槽内。
1.4.5. 电泳 加样后打开电源,将电流调至10mA,待样品进入分离胶后,改为20—25mA,当溴酚蓝前沿距离橡胶眶下缘1-20cm时,将电流调为0,关闭电源。
1.4.6. 染色脱色与制干板 贮存液 NAD 乳酸钠 NaCl NBT PMS 磷酸缓冲液 用量/ml 4.0 2.5 2.5 10.0 1.0 5.0 电泳结束后,取下凝胶膜,刮下硅橡胶框,撬开玻璃板,在凝胶右下角切出一小角作为标记,小心取出凝胶板,将其放在盛有染色液的培养皿中,置37度水浴中保温15-30min,待LDH同工酶呈现蓝紫色区带,即可用蒸馏水洗去染色剂,加入脱色液终止酶反应并使底色脱净,用凝胶成像仪拍照。 试验结果
结果讨论 根据以上试验结果,可以看出在肝、心肌、脑、骨骼肌、血清5种组织中同工酶中,同工酶LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5的含量有所不同,心肌中一LDH1含量最高,骨骼肌及肝中的LDH5最高。
本试验的影响因素以及做好试验的关键是: 制胶时应注意不能产生起气泡。插入梳子时应倾斜插入,以免产生气泡 电泳时电流不要太高,应防止热效应引起LDH失活,电泳应在冰浴中进行。 LDH同工酶活性染色时间不要太长,一般以15—30min为宜,当大多数条带均呈蓝紫色时即可中止染色。 电泳后应迅速拨胶,防止色带扩散。 所用器材必须清洁。特别是制备凝胶柱所用的玻璃管每次用后必须用洗液浸泡,再常规清洗,否则凝胶剥离困难。 电泳完毕后,上下槽电极缓冲液不可混合,因离子强度和pH值都已发生改变。 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂,对皮肤有刺激作用,应避免直接接触。 同工酶的染色原理: 将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的同工酶凝胶条,加上酶的底物乳酸,则可催化底物脱氢生成丙酮酸。同时生成还原型NADH+H+,它可使吩嗪硫酸甲酯(PMS)还原,后者又使浅黄色的氯化硝基四氮唑蓝(NBT)还原成蓝紫色,从而显示各同工酶区带。其反应式如下: 反应产生的蓝紫色即还原型NBT含量与酶活力成正比,可直接观察颜色的深浅进行分析,也可将染色的胶条用光密度扫描仪进行扫描,根据波峰计算出各同工酶的百分含量。
LDH同工酶的应用现状: LDH同工酶的分离及测定在临床上有重要意义。正常情况下,血清中LDH同工酶活性较低,电泳呈现其特定的同工酶谱。当某组织受损时,该组织中的LDH可释放到血液中,使血清 LDH的总活性升高,但酶的总活性升高幅度不一定与有关脏器(如心或肝等)的病损程度相一致,故测定酶的总活性对患病器官的鉴别意义不大。但LDH同工酶在不同器官组织中的分布及含量不同,有关的器官组织发生损伤时,可反映在同工酶谱的变化上,故测定LDH同工酶可有助于受损部位的鉴别诊断。如肝脏疾患时,血清中LDH;升高;而在心肌受损时,血清中 LDH,升高,因此电泳分离同工酶,经光密度扫描仪扫描,测出各同工酶的百分含量,不但提高了诊断的灵敏度,而且对病变器官的鉴别也有重要意义。 此项测定目前常用于诊断心肌梗塞,肝病和某些恶性肿瘤。在诊断心肌梗塞时虽然活性增高的时间比 CK要迟,阳性率也较低,但持续时间较CK长。 1.心肌疾病:心肌梗塞时LDH增高,心肌梗塞发病后8-10小时开始上升,2-3天达高峰,持续1-2周恢复正常。若LDH增高后恢复迟缓,或在病程中再次升高者,提示梗塞范围扩大,预后不良。 2.肝脏疾病:急性肝炎或慢性肝炎活动期LDH常显著或中度增高,其灵敏度低于ALT,肝癌时LDH活性明显增高,尤其转移性肝癌时LDH活性增高更明显。 3.血液病:白血病、贫血、恶性淋巴瘤等LDH活性增高。 4.其它:肌营养不良、横纹肌损伤、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也增高。 由于LDH存在于很多组织中,其总活性测定不能特异地反映某一组织或器官的情况,为了进一步了解某一器官的病变,可测定LDH同工酶有助于区别不同组织来源。 人血清中含有五种LDH同工酶,它们是由H(心肌型)和M[骨焰肌型)两类亚基组成的不均一的五种四聚体。按其在琼脂电泳中泳动的快慢,由正极向负极依次为LDHl、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。心脏、脑、红细胞等富含LDHl和LDH2,而肝脏及骨铬肌则含LDH4和LDH5最多。因此测定LDH同工醇有助于病变器官的定位。
参考文献: ① 刘箭 生物化学实验教程 科学出版社 ② 韦和平 生物化学实验与指导 中国医药科学出版社