谷氨酰胺转胺酶生产与应用

一   前言
 1谷氨酞胺转胺酶简介
 谷氨酞胺转胺酶（ Transglutaminase. E . C . 2 . 3 . 2 . 13 ，简称 TGase ）是一种催化酞基转移反应的酶．通过催化各种蛋白质分子之间或者分子内部形成。ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸键，从而提高蛋白质的功能特性和营养价值,
 人们最初在豚鼠肝脏中发现了这种酞基转移酶．随后在植物、无脊椎动物、两栖动物、鱼类、鸟类中都发现了 TGase ．但是这类 TGase 来源稀少，分离提纯工艺复杂，导致酶的价格十分昂贵不能用于食品工业．后来人们从微生物中提取到了这种酶，微生物来源的 TGase 催化活性不依赖 Ca2+ , 且提取工艺较简单，加之微生物易于大规模培养，已经得到广泛关注．
 2谷氨酰胺酶的应用
 2.1 在肉制品加工中的应用
 肉制品是人们获得蛋白质的重要来源，而肉制品加工是食品工业中的一个重要部分。由于肉制品的高的价格和人们对蛋白质充分利用的需要， 人们总是希望能利用动物体的一切可利用部分制成肉制品， 其中面临的一个问题是如何将一些低价值的碎肉进行重组，改善其外观、结构、风味， 以提高其营养价值和市场价值。谷氨酰胺转胺酶由于可以形成蛋白质分子内和分子间的交联， 因而在肉制品重组中得到广泛的应用， 这也是目前利用该酶最多的行业。人们通过研究发现在体外多种蛋白质可作为谷氨酰胺转胺酶的底物发生交联反应，包括乳清蛋白 、大豆蛋白、肌球蛋白和酪蛋白㈣等等。由于肌球蛋白是肉类中的重要蛋白， 而谷氨酰胺转胺酶能使肌球蛋白发生交联， 所以能够改善肉类的质构。对于蛋白质溶液， 由于蛋白质分子发生交联时会将水分子包裹在其中， 因而会发生凝胶化作用。Kim 等用谷氨酰胺转胺酶处理牛肌动球蛋白溶液， 然后用SDS—PAGE进行分离并用光密度法检测条带， 发现交联聚合的肌球蛋白从处理前的10.1±2.2％ 增加到20.7±3 5％，而未发生聚合的肌球蛋白单体则从未处理前的20.9±3.4％ 下降至处理后的13.0±2.7％ ，可见谷氨酰胺转胺酶催化的交联聚合作用比较明显。同时用共焦激光扫描显微镜还观察到了肌球蛋白凝胶的形成。由谷氨酰胺转胺酶催化的在蛋白质分子内和分子间形成的异肽键属于共价键， 在一般的非酶催化条件下很难断裂， 所以用该酶处理碎肉使成形后虽经冷冻、切片、烹饪也不会重新散开。肉类蛋白质之间发生交联后，使得肉制品更加富有弹性， 形成良好的口感， 而该酶对肉制品的其他风味不会产生影响。大量的试验证明用谷氨酰胺转胺酶处理的食品对人是安全的 事实上， 由于谷氨酰胺转胺酶广泛的存在于动物组织， 人们一直就在食用含有ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸异肽键的食物，谷氨酰赖氨酸完全能够被人体吸收利用。不仅如此， 赖氨酸是人体8种必需氨基酸之一， 也是在食品加工过程中最容易损失掉的一种氨基酸． 美拉德反应等多种食品加工过程中的副反应都会造成其损失，所以赖氨酸常成为食品中的限制性氨基酸， 而ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸异肽键的生成恰恰可以防止赖氨酸发生副反应。
 2.2 在乳制品中的应用
 乳制品中的α一酪蛋白， β一酪蛋白，κ一酪蛋白以及 α一乳清蛋白， β一乳球蛋白等都是谷氨酰胺转胺酶的良好的底物， 因而谷氨酰胺转胺酶在乳制品工业中也有很高的应用价值 。该酶能够在较宽的pH 范围内(pH6．5～8．0) 对乳品蛋白质进行交联。谷氨酰胺转胺酶在乳制品中的应用有：(1) 在奶酪生产中， 经谷氨酰胺转胺酶处理后， 可使乳清蛋白和酪蛋白发生交联， 可以提高奶酪的产量。用该酶处理牛奶可以增加其粘性。(2)将谷氨酰胺转胺酶交联过的酪蛋白脱水后可得到水不溶性的薄膜 ， 这种薄膜能够被胰凝乳蛋白酶分解， 因而是一种可食用性的膜， 能够用作食品包装材料等。(3)另据报道，谷氨酰胺转胺酶还可用于催化α一酪蛋白交联形成网络状结构，并将各种酶包裹在此网络结构中， 事实上， 交联的酪蛋白网络被用作了酶固定化的载体， 经这种固定化处理的酶能反复使用而不丧失活性。在谷氨酰胺转胺酶催化下，各种酶本身能与酪蛋白交联， 形成一种在可溶性一不溶性之间相互转化的酶催化系统。这些对于酶催化的理论和应用研究都是非常有意义的。
 2.3 向蛋白质分子引入限制性氨基酸
 各种不同类型的蛋白质的氨基酸组成是各不相同的，组成蛋白质的20种常见氨基酸中有8种是人体自身不能合成的必需氨基酸。如果某些蛋白质的必需氨基酸含量很低，那么它们的营养价值也低。特别是赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸等， 本身含量就不高， 而且在食品加工过程中还非常容易遭到破坏， 因而成为食品中的限制性氨基酸限制了食品的营养价值。谷氨酰胺转胺酶不仅能催化蛋白质分子内的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基之间生成异肽键交联，还能催化蛋白质分子内的谷氨酰胺残基和小分子的伯胺发生缩合连接。人们正是利用这一性质试图将小分子的氨基酸连接到蛋白质分子上去。不过为了达到这一目的，必须设法阻断蛋白质分子内部和分子之间发生谷氨酰胺残基和赖氨酸残基的交联反应， 因为这种反应会大大影响到氨基酸与蛋白质分子内谷氨酰胺残基的结合。利用马来酐对蛋白质分子中的赖氨酸残基的ε～氨基进行马来酰化修饰，可以有效的阻断蛋白质分子内和分子间的交联反应“”。有些蛋白质如牛血清白蛋白、卵清蛋白由于分子构象的关系， 无论是谷氨酰胺残基还是赖氨酸残基都接触不到谷氨酰胺转胺酶， 因而不是该酶的合适的底物，但是经过马来酰化修饰后由于构象发生变化， 谷氨酰胺残基暴露在外． 谷氨酰胺转胺酶能够催化其与氨基酸之间的连接反应。当蛋白质分子连上氨基酸后， 调节pH 至酸性范围内即可除去马来酰基。以L一甲硫氨酸乙酯作为底物． 谷氨酰胺转胺酶分别催化 α一酪蛋白、 β一酪蛋白、7S和1 1S大豆蛋白与之反应． 反应后这JL种蛋白质的甲硫氨酸含量分别比反应前增加了200％ 、15O％ 、240％ 和350％ ” 。用L一赖氨酸处理麦谷蛋白． 赖氨酸的含量比处理前增加了5.1倍。由此可见， 这是一种向氨基酸组成不理想的蛋白质中引入限制性氨基酸， 提高其营养价值的有效手段。
 2.4 蛋白质分子的去酰胺化
 当没有伯胺存在时， 水将作为氨基受体， 谷氨酰胺转胺酶催化蛋白质的谷氨酰胺残基发生水解生成谷氨酸。由于谷氨酰胺是不带电荷的中性氨基酸， 而谷氨酸是带负电荷的酸性氨基酸， 因此这种水解必然导致蛋白质的性质变化。一般来说．蛋白质去酰胺化后等电点将发生变化， 同时伴随着溶解性和对钙离子稳定性的提高。Nonaka等人的研究发现虽然来源于微生物的谷氨酰胺转胺酶对 酪蛋白的去酰胺化作用不如来源于儿内亚猪肝脏的谷氨酰胺转胺酶．但还是能明显改善蛋白质的溶解性和对钙离子的敏感性。他们还用脱乙酰几丁质颗粒对谷氨酰胺转胺酶进行了固定化研究， 发现固定化的酶不能作用于 α一酪蛋白、β一酪蛋白，但可以使二甲基酪蛋白、柠康酰化的7S大豆球蛋白发生去酰胺化作用，可见这是与蛋白质的构象有关的。谷氨酰胺转胺酶只在没有伯胺存在时才催化谷氨酰胺残基的水解， 因而在进行去酰胺化时必须阻断蛋白质分子中的赖氨酸的ε一氨基以及基质中的其它氨基． 以防止蛋白质分子内部和分子之间发生交联． 以及蛋白质的谷氨酰胺残基和基质中的伯胺连接。但是目前还缺乏经济安全的方法阻断基质中的氨基， 而固定化酶的方法效果也不理想．所以在食品行业中目前还没有广‘泛采用该酶来对蛋白质进行去酰胺化反应。2．5 其他应用除了上述几种应用外． 谷氨酰胺转胺酶还能应用于很多方面。谷氨酰胺转胺酶不仅可以催化同种蛋白质之间的交联，还能催化不同蛋白质之间的交联。各种蛋白质的氨基酸组成互不相同． 因而不同的蛋白质中的限制性氨基酸不一定相同， 通过谷氨酰胺转胺酶将它们连接起来， 可以达到优势互补的效果．提高蛋白质的营养价值。Kurth等人“在常温和中性pH 下利用谷氨酰胺转胺酶将非肉类的大豆蛋白、酪蛋白、谷蛋白连接到肉类肌球蛋白上。除此之外谷氨酰胺转胺酶作用于蛋白质后， 会明显提高蛋白质的溶解性、对酸稳定性、发泡性、乳化性、乳化稳定性等等
 
 3谷氨酰胺转胺酶的作用特点：
 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶， 它以肽链中谷氨酰胺残基的一羧酰胺基作为酰基供体， 而酰基受体可以是：
 多肽链中赖氨酸残基的ε一氨基， 形成蛋白质分子内和分子间的ε-（γ-谷氨酸）赖氨酸异肽键(图la)， 使蛋白质分子发生交联， 从而改变食物的质构， 改善蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性等许多物理性质；
(2)  伯胺基， 形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接(图lb)，利用该反应可以将一些限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价值；
(3) 水， 当不存在伯胺时， 水会成为酰基受体， 其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷氨酸残基(图1c)． 该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度

 4 谷氨转胺酶的来源
 长期以来，人们获得谷氨酰胺转胺酶的方法主要是从动物组织中提取， 如豚鼠、几内亚猪、兔子的肝脏、鱼组织等， 由于来源稀少、分离提纯工艺复杂， 导致该酶的价格十分昂贵， 不可能应用于食品工业 直到80年代末， 利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶见诸报道。1989年，Ando等人。 报道了他们从5000株菌株中筛选出Strepto—verticilium S-8112，Streptoverticilium sp.，Streptoverticilium griseocaneun， Streptoverticilium cinnam onen subp．Cinnam oneum和Streptoverticilium mobaraense能够以发酵法生产谷氨酰胺转胺酶， 后来人们发现链霉菌属中的其它一些菌株也能生产此酶，并对发酵过程进行了优化， 使得酶产量有了大幅度的提高， 为食品工业利用此酶创造了条件。微生物来源的谷氨酰胺转胺酶与动物来源的酶有着类似的催化性质，但在氨基酸组成、酶学性质等方面存在着比较大的差异。来自Streptoverticilium属的谷氨酰胺转胺酶是一种胞外酶， 相对分子质量在40KD 左右， 活性中心包含一个游离的Cys巯基， 与动物来源的谷氨酰胺转胺酶相比，微生物来源的酶表现出很多优势：
(1) 对钙离子的非依赖性；
(2) 对热、pH 的稳定性都明显优于动物来源的酶；
(3)更有利于保存， 经离心和过滤后的发酵液滤液在-20℃ 下可以贮存几个月，而酶活性仅损失10％，而经过纯化的酶则更加稳定。所有这些对该酶在工业过程中的使用都是很有利的。但是值得注意的是不同来源的酶对底物的专一性是有所不同的。

二  生产分离工艺
 国外对谷氨酰胺转胺酶的研究较多也较为深入，而我国则报道很少。已报道的制备方法主要有①从动植物组织中提取，② 由微生物发酵法生产。在这里我所介绍的方法是第二种：利用微生物发酵来规模化生产。
1 菌种来源及生产原料
发酵中使用的菌种Streptoverticilium mobaraense
碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉等；
氮源：无机和有机氮，如：硫酸铵、尿素、大米、玉米、酵母膏等；
还需要矿物质及微量元素，如：P，Mg，K，Zn，Fe及维生素。如果需要，还需加人非离子型表面活性剂。另外，由于合成这种酶的特异性．发酵液 离 分离为提高其产量及其酶活，据文献记载可能还需补充一些氨基酸，具体成分无法得知。
2 生产工艺
 整个发酵过程为好氧发酵，因此必需通氧并进行适当的搅拌。微生物生长和酶形成的温度在25℃ ～35℃之问，发酵时问由培养条件及谷氨酰胺转胺酶所达到的最高酶活决定，一般在2～4天。微生物谷氨酰胺转胺酶是一种胞外酶，溶解在发酵液中，因此发酵结束后，需对发酵液进行离心分离，除去菌体，然后对上清液进行分离提纯处理，和其它酶的纯化处理过程相似。通常应用在其它酶处理过程的技术，如：离子交换、色谱、纸层析、超滤等常应用在谷氨酰胺转胺酶的处理纯化中，并且常将这些方法有机结合使用，以提高酶的纯度和分离效率。最后如有必要，可以向酶中加人酶稳定剂。
3 分离纯化
 Ando等人 和Motoki等人最早对谷氨酰胺转胺酶的生产以及分离和纯化过程进行了报道。将微生物接种在100ml培养基中pH7．0，30℃ 时培养48小时，然后将发酵液加到20升的新培养基中，通气l0升／min，转速250rpm，30℃时培养三天，发酵液酶活性范围0．28-2．50u／ml，由所用菌种决定。下游过程如图2所示。经过这样的处理后，酶被纯化了l74倍，酶活的总回收率为42％。
 近年来，Geber等人对纯化谷氨酰胺转胺酶的提取分离过程进行改进。在发酵液被离心和过滤之后，一次性通过一个强酸性(Fractogel EMD)离子变换剂树脂，就可以得到纯化了128倍的谷氨酰胺转胺酶，酶活的平均回收达60％。该法选择性较强，分离效果好，酶活性损失少，且经过这样处理后，酶较为稳定，并且不需要加人稳定剂。
 通过对氨基酸代谢的分析，利用质量平衡，朱扬 提出某些氨基酸成为细胞生长和分泌谷氨酰胺转胺酶产品的瓶颈效应，因此培养基中还需补充适量的氨基酸，在Ando等人设计的培养基基础上，补充适量His，lie，和Met。利用这样的介质对微生物进行批量发酵时，谷氨酰胺转胺酶产量增加了4倍。

三   如何提高谷氨酰胺酶的稳定性。
    利用1994年gerben的方法进行提纯的时候，因为谷氨酰胺酶的稳定性较强，因此不需要加入稳定剂或进行化学修饰。但是为了便于回收利用并且提高酶的活性，可以用下列原理进行固定化处理。具体介绍如下：
1   吸附法
 利用形成离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。Mojovic等阎将从Candidarugosa(Candida sp．为念珠菌属)中提取的脂肪酶吸附固定在大孔共聚物载体上在最优条件下最大吸附量为15.4mg／g，酶固定效率为62％。动力学研究表明，脂肪酶是通过局部化学反应选择固定在载体上。在卵磷脂(异辛烷)存在下，固定酶水解椰子油，酶活力为游离酶的70％，重复使用15次后，固定酶活性仍保持其最初活性的56％。Kamata等同在恒温30℃、24h条件下的水溶液中，将胰蛋白酶和α-淀粉酶固定在珠状糖基蛋白上，实验过程无任何化学改性，所获得的固定化酶相对于固定在阴离子交换剂(器)或脱乙酰几丁质上的酶，有较长的生命周期。任广智等研究了磁性壳聚糖微球对脲酶的吸附固定，结果表明，磁性壳聚糖微球对脲酶的固载量与其粒径交联度及酶溶液的离子强度成反比，固定化脲酶的最适反应温度为80℃，比游离酶提高了10℃，固定化脲酶的最适pH值变化不大。
2   共价键合法
 先借助于一些方法，在载体上引进一活泼基团，然后，此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键的方法 。该方法常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中戊二醛应用最广泛，有研究认为其反应属于动力学二级反应 。
3   包埋法
 主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在凝胶内部的微孔中，而微胶包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中。Markvicheva等将细胞或酶包埋固定在大孔复合聚（N-乙烯基己内酰胺）-藻酸钙(PVCL—CaAlg)水凝胶上，并研究了固定酶的热稳定性和储存稳定性以及酶在水(有机)介质中的性能，实验表明，酶在65℃～80℃仍可使用，而天然酶在50℃～55℃时就完全失活。
4   新型固定化技术
 有人分别采用辐照聚合法和引发聚合法。以丙烯胺为单体，NN一亚甲基双丙烯酰胺为交联剂制备聚丙烯酰胺凝胶。在水合肼和Na2B O，存在制得聚丙烯酰胺固定酶。
 酶固定化过程中所应用的载体有以下几种，必须通过实验后才能确定哪一种载体更适合于这种酶使用。
1有机高分子载体
 主要有天然高分子载体材料和合成的高分子载体材料。天然高分子载体材料一般无毒性，传质性能好，但是强度低。常见的有琼脂、海藻酸钠、壳聚糖等。Subra．manian等用经CNBr活化和碱处理过的纤维素载体固定青霉素酰化酶(PA)，青霉素酰化酶的固定化效率为80％～85％。当青霉素G的浓度高于80g／L时，未观察到底物和产物对固定化酶的抑制作用。在40~C时，固定化酶裂解60g／L的青霉素G钾盐10次以上，没有观察到活性损失。PA固定后，活性为4．3U／g，在水解反应中，催化活性可保持10h，随后出现了明显的下降 。Guisan等 最先报道了表面富含醛基的琼脂糖对PA的固定化作用，固定化酶经"' ~_NaBH4处理后用于6一APA的生产。在此基础上，他们又研制出了乙酰基一Sepharose CL凝胶，固定化酶的活性和稳定性进一步得到提高。对琼脂糖凝胶固定PA的机理性研究发现，琼脂糖凝胶中的醛基可使酶以多点共价结合的方式被固定，结合酶的能力很强，可制备活性高的固定化PA，固定化酶的活性高达200U／gt 。合成的高分子载体材料主要有聚丙烯氰类、聚丙烯酰胺、凝胶聚丙烯酸类聚合物等。徐冠珠等 对PA在聚丙烯纤维上的固定化进行了许多的研究。将巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶以共价结合的方式偶联于聚丙烯腈纤维载体制成固定化PA，应用于水解青霉素G$IJ备6-APA，活性高达2000U／g，重复使用20次，保留活性的80％。固定化酶催化合成头孢氨苄的活性达153U／g，重复使用50批次，保留活性为83．9％。
2．2无机载体
 早期采用的无机载体材料有膨润土、氧化铝和玻璃等。这些材料能与酶吸附结合，但结合酶的能力颇低，载体结合酶的量往往低于lmg。后采用表面功能化的二氧化硅凝胶和微球、陶瓷、三氧化二铝 、海藻石和大孔玻璃等固定PA，但由于受到载体材料的孔径、比表面积、颗粒粒度等因素的限制，固定化酶的活性难以得到很大的提高。近年来，材料科学的迅速发展拓宽了无机载体固定化PA的研究，特别是以离子型层状材料和介孔分子筛固定化PA形成了新的亮点。层状材料因其在化学结构上的特殊性为固定化酶的研究者提供了新思路 。它一般是由正电性的板层与层问负电性的阴离子构成的无机材料，阴离子可与其它阴离子交换而达到调节板层间距的效果，它能够通过控制反应调节层问可反应性基团含量，使其对酶分子具有良好的亲和性，有利于酶活性的保持和寿命的延长。还有一种应用比较广泛的无机载体是介孔分子筛，M41s系列中孔分子筛是1992年美国Mobile公司的研究人员首次使用烷基季铵盐型阳离子表面活性剂为模板剂合成的新型沸石材料 ，具有1．3nm～30nm可调的较大孔径、高的比表面积、较小的扩散阻力、孑暾面富含弱酸性的羟基闭。介孔分子筛固定化酶一般是以载体与酶分子之间的氢键作用或修饰后与酶分子共价结合来实现。
2．3复合载体
 利用有机聚合物载体键合蛋白能力强、易成型及无机聚合物载体刚性的大孔结构特点，可使二者结合成复合载体。Baha 研究表明，磁性体Fe o4与聚苯乙烯含醛化合物一起混合可以制得磁性载体，其固定化葡萄糖氧化酶保留活性可达70％。Hofmann等用N一异丙基丙烯酰胺同丙烯酰胺共聚得到热可塑性凝胶载体，通过载体上的琥珀酰亚胺酶固定在该载体上，通过温度来调节其膨胀和聚沉。