黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定方法概述(二)

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（一）原理简介

高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。据2004年统计，世界上化合物总数多达4700多万种，可用气相色谱分析（GC）的约占20%，而80%则需用高效液相色谱(HPLC)来分析。

高效液相色谱（HPLC）特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物及生物活性物质的分离和分析，并且可以制备。

因其独特高效的提取效率，广泛应用于药物的提取中，包括解热镇痛药、镇静药、甾体药、抗菌药、中草药等其它药物。

(二)、HPLC的特点

1、高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

2、高速-流速为0.1~10.0 ml/min。

3、高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

4、高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

5、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

6、速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。

7、分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

8、灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

9、柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。

10、样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

三、黄连及其制剂中生物碱类化合物的HPLC测定实例

（一）、复方黄连胶囊中小檗碱的测定

复方黄连胶囊由黄连、连翘、防风、川芎等多味药组成，具有散风清热、泻火止痛的功效。主治湿热蕴毒所致的痢疾、黄疸，症见发热，黄疸，吐泻，纳呆，尿黄如茶，目赤吞酸，牙龈肿痛，或大便脓血。

1、仪器和材料

美国惠普HP1100高效液相色谱仪，HP1100工作站；盐酸小檗碱对照品（中国生物制品检定所，批号20190107，供含量测定用）。复方黄连胶囊为安徽中医药大学第一附属医院药学部自制，批号分别为190325，乙腈为色谱纯。

2、方法

色谱柱为依利特BP色谱柱（4.6mmX200mm,5um）；柱温40℃；流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液（pH=5.0）；流速为1.0ml/min；检测波长为268nm。

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用纯化水配置为盐酸小檗碱0.0034mg/ml的对照品溶液。取复方黄连胶囊内容物1.6g，置锥形瓶中，加入盐酸-甲醇（1:100）50ml，密塞，称定重量，超声30min，放冷再称定重量，用盐酸-甲醇（1:100）补足减失的重量，摇匀，取上清液用微孔滤膜（0.45um）滤过，取过滤液。

取盐酸小檗碱对照品溶液，分别进样3、5、10、15、25ul注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

精密称取供试品（批号190325）0.80g,按前述方法制备供试品溶液，精密吸取10ul，每隔一定时间进样，测定盐酸小檗碱峰面积。同批号样品3份进样，测定峰面积。

分别精密吸取对照样品溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。

3、结果

盐酸小檗碱的回归方程为Y=2874.2X+17.224,决定系数r=0.9999。复方黄连胶囊中的小檗碱含量如下。

【表1】

样品批号盐酸小檗碱含量mg 回归率（%）

190325 0.032 100.14

0.034 100.42

0.032 99.18

4、讨论

在实验中，对实验中盐酸小檗碱对照品溶液，在200-400mm分别进行光谱扫描，各成分在268mm处吸收值较大，灵敏度较高，故选择其为测定波长。本研究所建方法简便准确，重现性好。

（二）、一清颗粒中盐酸中小檗碱的测定

一清颗粒为药典方，为临床常用药，功效为清热泻火解毒，化瘀凉血止血。全方由黄连、大黄、黄芩三味中药组成。

1、仪器和材料

美国惠普HP1100高效液相色谱仪，HP1100工作站；盐酸小檗碱对照品（中国生物制品检定所，批号20190107，供含量测定用）。批号190507一清颗粒从安徽国胜大药房购入，乙腈为色谱纯。

2、方法和样品测定

色谱柱为依利特BP色谱柱（4.6mmX200mm,5um）；柱温40℃；流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液（pH=5.0）（28:72）；流速为1.0ml/min；检测波长为268nm。

对照品溶液的配制，称取盐酸小檗碱对照品5.12mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.205mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备，取颗粒少许，精密称取粉末2.0g,置500ml烧杯中，加沸水约300ml使溶解，放冷后加入稀盐酸3ml,摇匀，转移至500ml量瓶中，加水至刻度，摇匀并高速离心，精密量取上清液4ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。

精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别吸取上述5种溶液各10ul，进行分析2次，记录色谱图，用平均峰面积（Y）对盐酸小檗碱质量（ug）回归分析，得回归方程Y=15440.3X+0.5，决定系数r=0.9998,表明硝酸小檗碱0.205-1.025ug范围内具有良好的线性关系。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，按上述色谱条件实验，测定峰面积，以外标法计算供试品溶液中盐酸小檗碱的含量。通过计算，批号190503的一清颗粒中盐酸小檗碱含量为2.90mg/g;批号190507的一清颗粒中盐酸小檗碱含量为2.83mg/g；批号190511的一清颗粒中盐酸小檗碱含量为2.78mg/g。

3、讨论

通过实验表明文中供试品溶液制备方法能把供试品中的盐酸小檗碱完全提出，分离效果好、杂质峰少，可以作为该试剂中盐酸小檗碱含量的测定方法。

（三）、消糖灵胶囊中盐酸中小檗碱的测定

消糖灵胶囊是由人参、黄连、天花粉、杜仲、枸杞等中药加优降糖组成的方剂，具有益气养阴、清热泻火等功效。

1、仪器和材料

美国惠普HP1100高效液相色谱仪，HP1100工作站；盐酸小檗碱对照品（中国生物制品检定所，批号20190107，供含量测定用）。消糖灵胶囊从安徽广济大药房购入，乙腈为色谱纯。

2、方法和样品测定

色谱柱为依利特BP色谱柱（4.6mmX200mm,5um）；柱温40℃；流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液（pH=5.0）（28:72）；流速为1.0ml/min；检测波长为265nm。

对照品溶液的配制，称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇溶解并稀释至0.4mg/ml的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备，取颗粒少许，精密称取内容物5.0g,研细，精密称取0.5-1.0g,置于50ml烧杯中，加盐酸-甲醇（1:100）40ml，超声处理30min,加甲醇至刻度，过滤，摇匀，即得供试品溶液。

精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10、20ul以此进样，测定峰面积，用平均峰面积（Y）对盐酸小檗碱质量（mg）回归分析,得回归方程Y=3682.4X+15.65，决定系数r=0.9999，表明盐酸小檗碱在0.08mg-0.8mg范围内线性关系良好。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，按上述色谱条件实验，测定峰面积，以外标法计算供试品溶液中盐酸小檗碱的含量。通过计算，批号190601的消糖灵胶囊中盐酸小檗碱含量为1.33mg/g;批号190608的消糖灵胶囊中盐酸小檗碱含量为1.40mg/g；批号190610的消糖灵胶囊中盐酸小檗碱含量为1.22mg/g。

3、讨论

通过实验表明文中供试品溶液制备方法能把供试品中的盐酸小檗碱完全提出，分离效果好、杂质峰少，可以作为该试剂中盐酸小檗碱含量的测定方法。

四、参考文献

[1]陈馥馨，高晓山，含黄连方剂及黄连配伍的文献统计。中成药，1997,19（8）：40-41.

[2]陈芝芸等，100味中药对幽门螺杆菌抑菌作用的实验研究。时珍国药研究，1996，7（1）：25-16

[3]中国药典［S］.一部.2005：213.

[4]樊冬丽，廖庆文，鄢丹，等.黄连不同炮制品中生物碱类成分的比较研究［J］.解放军药学学报，2006，22（4）：276-279.

[5]王克英，方玲芬.酒黄连中小檗碱HPLC含量测定［J］.中国中药杂志，2007，32（22）：2443-2444.

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