葛根芩连片的含量测定研究进展

葛根芩连片的含量测定研究进展

一、葛根连片的简介

1、主要功效

解肌清热，止泻止痢。

2、适用病症

用于泄泻痢疾，身热烦渴，下痢臭秽；菌痢、肠炎。

3、用法用量

口服。一次3～4克，一日3次。

4、药性分析

方中重用葛根发表解肌，升发脾胃清阳，是为君药；黄芩、黄连清肠胃之热邪，是为臣药；甘草甘缓和中，并能调诸药，是为使药。诸药配合成方，共奏解表清里之功。

二、有关含量测定方法的介绍

1、UV法测定

UV分光光度计是利用紫外可见吸收光谱法，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，来进行药品的鉴别、纯度检查及含量测定的测量装置。紫外可见吸收光谱法自问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。紫外可见吸收光谱的基本原理是利用在光的照射下待测样品内 部的电子跃迁，电子跃迁类型有：（1）σ→σ* 跃迁 指处于成键轨道上的 σ 电子吸收光子后被激发跃迁到 σ* 反键轨道（2）n→σ* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的 n 电子吸收能量后向 σ*反键轨 道的跃（3）π→π* 跃迁 指不饱和键中的 π 电子吸收光波能量后跃迁到 π*反键轨 道。（4）n→π* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的 n 电子吸收能量后向 π*反键轨 道的跃迁 。电子跃迁类型不同，实际跃迁需要的能量不同： σ→σ* ～150nm n→σ* ～200nm π→π* ～200nm n→π* ～300nm 　吸收能量的次序为：σ→σ*>n→σ*≥π→π*>n→π* 　特殊的结构就会有特殊的电子跃迁，对应着不同的能量（波长），反反映在紫 外可见吸收光谱图上就有一定位置一定强度的吸收峰，根据吸收峰的位置和强度就可 以推知待测样品的结构信息。

2、HPLC法测定

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

高效液相色谱法有“四高一广”的特点：

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

三、葛根芩连片含量测定的实例

葛根

照高效液相色谱法（2010年版药典一部附录Ⅵ D）测定。

 1、色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－乙腈－水（6：10：84）为流动相；检测波长为250nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于2500。

2、 对照品溶液的制备

取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇－水（70：30）的混合溶液制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。

3、供试品溶液的制备

取本品10片，包衣片除去包衣[1]，精密称定，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－水（70：30）的混合溶液50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每片含葛根以葛根素（C21H20O9）计，不得少于9.6mg。

黄连

照高效液相色谱法（2010年版药典一部附录Ⅵ D）测定。

1、色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－5mmol/L十二烷基硫酸钠溶液（用冰醋酸调节至pH 4.0）（52：48）为流动相；检测波长为348nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4500。

2、对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇－盐酸（100：1）的混合溶液制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

3、供试品溶液的制备

取本品10片，包衣片除去包衣[1]，精密称定，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－盐酸（100：1）的混合溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率180W，频率35kHz）20分钟，放冷，再称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

 4、测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

1 实验部分

　　1.1 仪器

　　Waters 2695高效液相色谱仪(Waters2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站)，超声波清洗器(KQ2200DB，40kHz，80W，上海新苗医疗器械制造有限公司);混合纤维素酯微孔滤膜(孔径：0.45μm)，电子分析天平(Sartorius BS 224 S), SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

　　1.2 试剂与材料

　　甲醇(色谱纯，20070315112)，乙醇(分析纯，20070827093)，黄芩苷对照品由中国药品生物制品鉴定所提供(批号110715-200212，供含量测定使用)，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。葛根芩连片(河南禹州市药王制药有限公司，批号分别为081005、081010、081012)。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件与系统适用性考察

　　Agilent ZORBAX SB-C18 (Stable Bond Analytical 4.6×250mm，5μm)色谱柱;流动相：甲醇-0.2%磷酸水(50：50)，流速：1ml /min，柱温30℃，检测波长280nm，在此色谱条件下，理论塔板数大于7000，分离度大于1.5，进样量为10μl。

　　2.2 对照品溶液的制备

　　精密称取黄芩苷对照品适量，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.483mg/ml的黄芩苷对照品溶液。

　　2.3 供试品溶液的制备

　　取供试品10片，研细，混匀，精密称取相当于平均每片的样品重量，置50ml容量瓶中，精密加入70%乙醇50ml，摇匀，称定重量，超声处理(功率200W，频率50Hz)30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。以上所配溶液的HPLC色谱图见图1。图1 样品HPLC色谱图

　　黄芩苷对照品(A)、供试品(B)及阴性样品、(C)HPLC色谱图

　　光谱纯度分析及样品中黄芩苷色谱峰定位分析：选择与黄芩苷对照品相对应的色谱峰进行光学纯度分析，以保证此色谱峰的光谱纯度较高，没有共流物的出现。

　　PDA光谱纯度分析设定波长为210～400nm全波段扫描。由以上四个光谱纯度分析图上可以看出：在供试品11.050min的色谱峰位置与黄芩苷对照品光谱有较大相似，如图2、图3;将两者光谱重叠得到PDA光谱区别图(如图4)，由图4中可以看出，区别曲线在0.000范围内波动较小，并且由PDA数据校正产生纯度与阈值角度上来看 (如图5) ，PDA光谱匹配角度为0.678，PDA匹配的阈值角度为1.272，光谱匹配角度<匹配的阈值角度，说明该色谱由较高光谱纯度;由PDA光谱纯度分析图中可以看出，自动阈值角度>色谱纯度角，说明该色谱峰的光谱纯度较高，没有光谱共流物的出现，可以作为样品中黄芩苷进行定量分析。

　　2.4 线性关系考察

　　分别精密吸取“2.2”项下的黄芩苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱，以峰面积为纵坐标，以黄芩苷浓度为横坐标进行回归计算，得线性回归方程为Y=2.82×104X～9.24×104，r =0.9998(n=5),结果表明在19.32～96.60μg/ml范围内与黄芩苷的峰面积呈良好的线性关系。图2 黄芩苷对照品PDA光谱图图3 供试品在11.050min色谱的光谱图图4 对照品与供试品PDA光谱区别图图5 PDA光谱纯度分析图

　　2.5 精密度试验

　　精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，并进行测定，测定其RSD为0.75%，表明精密度良好。

　　2.6 稳定性试验

　　按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，立即进样，分别于0、4、8、16、24、48、72h进样，测定其RSD值为0.83%(n=6)，结果表明，供试品溶液在48h内稳定性良好。

　　2.7 重复性试验

　　按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，制备5份供试液，精密吸取供试品溶液10μl，并进行测定，RSD为0.91%(n=5)，说明供试品溶液的重复性良好。

　　2.8 加样回收试验

　　取葛根芩连片(批号 081012)10片，按照“2.3”项下制备供试品溶液，制备同时加入适量对照品溶液，用70%乙醇稀释至刻度，再取0.5ml此溶液至10ml容量瓶中，加入甲醇定容，进行测定，记录色谱，计算其RSD=0.62%(n=6)，其结果见表1。　表1 加样回收率实验

　　2.9 黄芩苷的含量测定

取3个不同批号的葛根芩连片按“2.3”项下制备供试品溶液，分别进样10μl，测定(n=3)，取三次测定平均值。

【参考文献】

  　1 国家药典委员会.中国药典，2005年版一部.北京：化学工业出版社，2005: 211-212.

　　2 温华珍,肖盛元,王义明,等.黄芩化学成分及炮制学研究.天然产物研究与开发, 2004, 16(6): 575-580.