王不留行抗人肝癌细胞株HepG2的作用研究(二)

2.1.3常用试剂配置

消化液的配制：双蒸水配制胰酶消化液，组成为胰酶0.25%，EDTA，NaCl0.8%，KCl0.02%，Na2HPO4·12H2O0.35%，KH2PO40.02%，溶解后超净台内经0.22μm滤膜无菌过滤，分装后置-20℃保存。

PBS配制：以双蒸水配制，组成为NaCl0.8%，KCl0.02%，Na2HPO4·12H2O0.35%，KH2PO40.02%，经0.45μm滤膜过滤后121℃高压灭菌15min，4℃保存。

MTT溶液：以PBS配制浓度为5mg/mL的MTT溶液，超净台内经0.22μm滤膜无菌过滤，15mL分装，-20℃避光保存。

2.1.4试验用细胞株

人肝癌细胞HepG2

2.2实验方法

2.2.1王不留行活性馏分制备过程

王不留行干燥根茎经60%乙醇回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩后经石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇依次萃取。取提取物20mg，加入100μL生物级DMSO溶解，配制成浓度为200mg/mL的储备液，4℃保存。

2.2.2粗提物及正丁醇层对HepG2细胞生长抑制活性检测（MTT法）

取对数生长期的HepG2细胞，接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔加入100μL，置37℃，5%CO2孵箱中培养12h，使贴壁。分别加入100μL不同浓度的阿霉素(ADR)、王不留行粗提物、正丁醇层，每个浓度设3个复孔，置37℃、5%CO2孵箱中培养24h。每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，继续在孵箱中孵育4h。弃去上清，每孔加入150μLDMSO，于490nm处测定吸光值(OD值)。分别计算不同药物抑制细胞生长的IC50，并按下列公式计算抑制率(InhibitionRate，IR%)。

IR%=(空白对照OD-样品OD)/(空白对照OD-空白调零OD)×100%

2.2.3正丁醇萃取层对HepG2细胞凋亡活性的形态学观察（Hoechst染色）

取处于对数生长期的细胞，以2×105个/mL接种于6孔板中，2mL/well。细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养12h，使细胞贴壁。将正丁醇层提取物储备液用培养基稀释，使其终浓度依次为12.5，25，50,100μg/mL。每个浓度的药物设3个复孔，每个6孔板分别设3个空白对照组。在室温、避光的条件下，加入Hoechst染色孵育，结束后，弃去含染料的培养基，用预冷的PBS清洗2遍。将6孔板置于荧光显微镜上，调节荧光模块，按一定顺序观察细胞形态变化，拍照。

2.2.4正丁醇萃取层对HepG2细胞胞内活性氧（ROS）生成的影响

取对数生长期HepG2细胞，消化后计数板计数，调整细胞密度为1.0×105个/mL，接种于6孔细胞培养板内，2mL/well，置于37℃、5％CO2培养箱孵育，待细胞贴壁后给予加药处理，给药12h后进行DCFH-DA探针的装载并收集细胞进行检测，具体操作步骤如下：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA。去除上清培养液，用PBS洗1-2次，每孔加入2mL稀释好的DCFH-DA，37℃培养箱内孵育30min后，再用PBS洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。胰酶正常消化后收集细胞于流式检测管内，应用流式细胞仪进行ROS释放量检测。

2.2.5正丁醇萃取层对HepG2细胞凋亡活性的影响

取对数生长期的细胞以2×105个/mL密度接种于6孔板中，2mL/well。细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养12h，使细胞贴壁。将正丁醇层提取物储备液用培养基稀释，使其终浓度依次为20，40，60μg/mL。每个浓度的药物设3个复孔，每个6孔板分别设3个空白对照组。将6孔板中的旧培养基弃去，空白组加入2mL含有10%FBS的新鲜培养基，加药组分别加入含有对应浓度药物的培养基，2mL/well。放入细胞培养箱中继续培养一定时间。孵育结束后，将旧培养基转置于15mL离心筒，每孔用预冷PBS清洗2遍，将细胞用适量0.25%胰酶充分消化后加入旧培养基，吹打均匀后转置于15mL离心筒，在4℃、3000rpm的条件下离心10min之后用PBS充分重悬、清洗细胞，于4℃、2000rpm的条件下再次离心10min。弃去上清液，每个离心筒加入500μLBindingBuffer重悬细胞后转置于流式管中，每管分别加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI工作液，涡旋混匀，400目滤网过滤使细胞成单细胞悬液，室温、避光、反应5~15min后利用流式细胞仪检测。

3实验结果

王不留行粗提物及正丁醇层的体外抗肿瘤活性考察，选取了人肝癌细胞株HepG2，药物对HepG2细胞株作用24h后的抑制率结果，见表3.1-A及表3.1-B。结果显示：随着给药浓度的增加，药物对HepG2细胞株的抑制率增加。结果表明：王不留行粗提物及正丁醇层对人肝癌细胞株HepG2有呈剂量依赖型的增殖抑制作用。   

表3.1粗提物(A)及正丁醇萃取层(B)对HepG2细胞的抗增殖作用(IR,mean±SD,n=3)

药物浓度(μg/ml) 12.5 25 50 100

IR(%) 15.72±0.37 22.87±2.16 44.18±0.36 72.34±0.21

   A:

药物浓度(μg/ml) 12.5 25 50 100

IR(%) 22.35±0.43 38.31±0.47 50.33±0.75 85.41±0.53

    B:

对照组HepG2细胞呈梭形或不规则形，上皮性贴壁生长，细胞均质而透明，一般具有2-4个核仁，核膜、核仁轮廓明显，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛。正丁醇层作用24h后，细胞数量明显减少，细胞间隙变宽。部分早期凋亡细胞出现冒泡现象，核膜及细胞膜清晰可见，细胞变圆浮起，胞质中颗粒增多，染色质浓缩，固缩成斑块状，有明显的凋亡小体产生。如图所示

     

             正丁醇萃取层对HepG2细胞株作用的形态学观察

  （A：12.5μg/ml；B：25μg/ml；C:50μg/ml;D：100μg/ml）

根据流式细胞仪检测结果Fig.3.3可以看出，经正丁醇层药物处理24h后，HepG2细胞的ROS释放量显著增加，即正丁醇层提取物可以浓度依赖性的促进HepG2细胞内ROS的生成。

细胞形态学观察结果显示，正丁醇层可诱导HepG2细胞产生明显的凋亡迹象。因此，采用AnnexinV-FITC流式细胞术进一步检测正丁醇层对HepG2细胞凋亡的影响。选取了12.5、25、50、100μg/mL四个浓度的药物分别与HepG2细胞作用24h之后，用AnnexinV-PI双染法对细胞进行染色，收集样品上机检测。各浓度的双染结果见图。结果显示：随着药物浓度的增加，正丁醇层促进AnnexinV及PI阳性细胞率增加。结果说明：正丁醇层可诱导HepG2细胞凋亡，且呈浓度依赖型

   

 正丁醇萃取层对HepG2细胞胞凋亡活性的影响

4.实验小结

癌症的发病率及死亡率一直呈上升趋势，现已成为全世界面临的最严重的公共问题之一。本研究选取了人肝癌细胞株HepG2，对王不留行及其正丁醇层的体外抗肿瘤活性进行考察。得出结论：王不留行及其正丁醇层对人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用呈剂量依赖性。由于正丁醇层提取物对HepG2细胞株的抑制作用最明显，具有进一步研究的价值，故最终选取王不留行正丁醇层作为进一步的活性研究和机制探讨的测试药物。

为了进一步验证王不留行正丁醇层对肿瘤细胞株的增殖抑制作用机制，选取了人肝癌细胞株HepG2细胞系，对正丁醇层的体外抗肿瘤活性进行机制探讨。通过Hoechest33258染色法观察细胞形态学改变、ROS生成实验考察对细胞胞内活性氧生成的影响、AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡率考察了王不留行正丁醇层诱导HepG2细胞的凋亡作用。

综上所述，本课题为王不留行的抗肿瘤临床应用提供了新的参考，对王不留行进行的体外抑制肝癌细胞增殖实验研究提供了一定的参考。

三、参考文献

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