山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 (4)(二)

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4　抗脑缺血作用：山楂叶总黄酮可明显提高模型小鼠脑组织LDH及SOD活力，对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织有明显的保护作用，其机制与抗氧化有关。

5　对血液流变学作用：山楂总黄酮3个剂量(80、40、20 g/kg)均有降低急性血瘀模型大鼠全血比黏度、血浆黏度和红细胞压积的活血化瘀作用。山楂醇提取物对中、低切全血比黏度有显著降低作用。

6　对血管内皮细胞的作用：不同剂量的山楂对氧化修饰的低密度脂蛋白引起的人脐静脉内皮细胞(EC)损伤和对EC的直接作用表明，山楂能抑制低密度脂蛋白的氧化修饰，减少脂质过氧化物的形成，阻断有害物质的产生，可通过直接作用于内皮细胞，调节内皮细胞功能，增强内皮细胞对有害因子的抵抗力和耐受性，从而保护内皮细胞免受损害。

7 消化系统作用：山楂可单味应用，亦可与神曲、麦芽、莱菔子等配伍，加强消食化积之功。其含维生素C、维生素B、胡萝卜素及多种有机酸，口服能增加胃中消化酶的分泌，所含蛋白酶、脂肪酸，可促进肉食分解消化。

8　糖代谢及抗氧化作用：应用6%的山楂水煎剂可明显降低高脂饮食大鼠空腹血清胰岛素和MDA水平，表明其可改善高脂饮食大鼠的胰岛素血症，增强机体抗脂质氧化作用，其机制可能与调节糖代谢有关，其药效物质基础可能与金丝桃苷和熊果酸有关。

山楂具药食双重价值，我国盛产山楂，资源丰富，经济物廉。近几年来，其在心脑血管系统疾病中的防治作用成为许多学者的研究热点，有希望开发成为新型的防治心脑血管系统疾病的药物。不仅可将山楂开发成各种保健品，还可提取活性成分，制成制剂用于临床，有着广阔的开发前景。

（二）、山楂中含有的黄酮类化合物

黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。生长在南太平洋所罗门群岛中的原珍向天果这种野生植物同样含有丰富的黄酮化合物成分，具有很广范的药用功效，马来西亚草药目录》中记载，原珍向天果味苦、涩、性凉，解热、收敛、种仁强壮!其种子主治:糖尿病、高血压。

（三）、黄酮类化合物一般的测定方法

黄酮类化合物是广泛分布于自然界中的一类化合物，生活中常见的食品茶叶、豆类、蔬菜、蜂蜜等都含有大量的黄酮类化合物。黄酮类化合物具有C6-C3-C6的基本骨架，是许多植物成分的活性化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。

1.分光光度法

　　分光光度法主要适用于总黄酮的测定，具有操作简便、快速、准确度及精密度较好的特点。目前黄酮类化合物测定法有直接测定法和比色法。直接测定法直接以黄酮类化合物为对照物测定样品中的此成分的含量，比色法是将化合物加入显色剂后测定吸光度再进行换算测定，其中常用的显色剂有Al（NO3）3和AlCl3。直接测定法和比色法的选择要综合考虑，样品中成分是否会与显色剂发生沉淀反应、样品成分的复杂性等都会影响结果的准确性，在NaNO2-Al（NO3）3-NaOH体系中，碱性条件经常会影响结果的准确性和稳定性，只有物质中含有邻二酚羟基，并且邻二酚羟基的邻位没有取代时， Al（NO3）3比色法才在 510 nm左右有最大吸收。

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2. 薄层色谱法（TLC）

　　薄层色谱法是一种进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法，薄层色谱法主要用于黄酮类化合物的定性和半定量分析，可同时测定多个样品，跟高效液相色谱法相比，薄层色谱法仪器设备简单，操作方便，但由于其影响因素较多，灵敏度和精确度方面不如高效液相色谱法。

3.高效液相色谱法（HPLC）

　　高效液相色谱法适用于极性大、沸点高、分子量大、热稳定性差的化合物分析，是黄酮类化合物分离检测中使用非常广泛的一种方法，具有效率高、灵敏度高、分离效率高等优点。高效液相色谱法采用液体为流动相，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。黄酮类化合物的分离中常用的色谱柱是C18柱，对复杂化合物的分析经常采用梯度洗脱系统，实现高效率的分离，紫外检测器、二极管阵列检测器是黄酮类化合物分析中最常用的检测器，具有灵敏度较高，线性范围宽，噪声低，适用于梯度洗脱的特点。

4、毛细管电泳法（CE）

　毛细管电泳是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的微分离分析技术，有多种分离模式，毛细管区带电泳，胶束毛细管电泳，毛细管等速电泳，毛细管凝胶电泳等。黄酮类化合物分离中经常应用毛细管区带电泳和胶束毛细管电泳。分离中常用的缓冲溶液是硼砂，常用的缓冲体系有硼砂-氢氧化钠，硼砂-磷酸二氢钠，硼砂-硼酸体系，少量报道也采用过中性磷酸盐的体系。在碱性条件下，黄酮类化合物中的顺式二羟基与硼酸形成带负电荷的硼酸类配合物，在电场作用下发生移动

4.（四）、有关山楂中黄酮类化合物测定的实例

1、章弘扬等采用高效液相色谱-质谱法鉴定了山楂中的绿原酸、原花青素 B2、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷，采用反相色谱-二极管阵列检测法同时定量测定了其含量。

2、对山楂叶中的黄酮类化合物进行HPLC 分析，多以金丝桃苷和以牡荆素为标准品，但牡荆素鼠李糖苷为山楂的专属性成分，以牡荆素鼠李糖苷为标准品进行了山楂叶中黄酮类化合物的HPLC分析。在实验过程中，发现此流动相体系的选择比较困难，经过反复摸索，选择了流动相配比，分离效果较好，在此条件下牡荆素鼠李糖苷与山楂中其它成分达到较好的分离。在提取山楂叶中的黄酮类有效成分时，比较了传统工艺和超高压提取工艺，超高压提取方法的优点是提取速度快、杂质少、收率高，因此采用了超高压提取技术进行了黄酮类化合物的提取，然后采用HPLC进行检测，大大缩短了样品的分析测试时间。

实验结果表明，山楂叶中的总黄酮和牡荆素鼠李糖苷的含量，既不是花期最高，也不是秋季摘果后最高。而是从花期（5月下旬）开始，逐渐增高，到8月份达到最高，然后随着果实的成熟，含量逐渐下降，到落叶时（10月下旬）含量最低。因此，如果以提取山楂叶中的黄酮类化合物为目的，应该选择8月初的山楂叶，此时的总黄酮和牡荆素鼠李糖苷含量都是最高，为合理的采收和利用提供了理论依据。为充分利用有限的中药资源，应该选择最佳的采收期，从而提高中药的利用价值。

3、黄酮类化合物无论是游离的黄酮甙元还是黄酮甙都易溶于乙醇、甲醇等溶剂中。根据文献,丙酮的提取效果比乙醇、甲醇好,以70%丙酮提取最好。但是由于丙酮价格较贵且含有毒成分,生产上一般不用。乙醇的提取质量分数低于60%时过滤出现困难,而且为了后续的过滤、回收溶剂、干燥等操作也比较容易,所以以70%乙醇溶剂进行提取。

山楂籽粉碎粒度对浸提效果的影响粒度不同浸提效果也不同,粒度小浸提效果好,但粒度不宜过小,否则过滤出现困难。以过20目、40目、70目、140目筛的几种粒度的山楂籽粉末进行比较,结果表明,以140-70目山楂籽粉末浸提效果最好。

（五）、参考文献

1.Li B, Zhang K, Cao W D, et al. Determination of hyperoside in hawthorn leaves byHPLC［J］.Chinese Pharmaceuticals (中国药业)，2003，12(12)：37

2.Zhong Y, Yang S J, Wang J, et al. Determination of Vitexin in leaf of Crataegus pinnatifida Bge. by HPLC ［J］. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research (时珍国医国药)，2000，11(10)：871.

3.Sun J Y, Yang S B, Li G H. Investigation on method speciality in identifying Fructus Crataegi with vitexin rhamnoside［J］.Zhong Yao Cai (中药材)，2001，24(12)：859.

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