葛根芩连片的含量测定研究进展(二)

江汉美等［12］采用反相高效液相色谱法，用Agilent ZORBAX SB-Cl8柱(4.6×250mm，5um)，以乙腈：0.05mol／L三乙胺溶液(用磷酸调节pH至3.0) (25：75)为流动相，检测波长为347nm，柱温为室温，供试品溶液制备采用盐酸：甲醇(1：100)溶液超声提取30min。结果：RP—HPLC法测定方中盐酸小檗碱的含量在0.16~0.80ug（r=0.9993）范围内线性关系良好；重复性6份供试品溶液峰面积的RSD为2.7%；供试品溶液在12h内稳定；平均加样回收率为97.0％，RSD为1.3％。

吴永芹等［13］采用高效液相色谱法以Diamonsil C18 (4.6×250mm，5um)为色谱柱，以乙腈：5mmol·L-1十二烷基硫酸钠溶液(用冰乙酸调pH 4.0) (52：48) 为流动相，检测波长为348nm，柱温为室温，供试品溶液制备采用盐酸：甲醇(1：100)溶液超声提取20min。结果：盐酸小檗碱在0.1008~2.52ug (r=1.000)范围内线性关系良好；重复性6份供试品溶液含量的RSD为0.92%；供试品溶液在24h内稳定；平均加样回收率为101.2%，RSD为1.3％。

2.3 葛根芩连片中黄芩主要活性成分黄芩苷的含量测定方法

2.3.1采用 HPLC色谱法

王小龙［14］采用高效液相色谱法等度洗脱，Kromasil Cl 8 (4.6×250 mm，5um) 为色谱柱；流动相为甲醇：水：磷酸 (50：50：0.2)；检测波长为276 nm，柱温为30℃；供试品溶液制备采用50%甲醇超声提取30min。结果：该方法浓度在0.16～1.88 ug( r=0.9998) 范围内线性良好；重复性5份供试品溶液黄芩苷峰面积的RSD为1.05%；供试品溶液在5h内稳定；平均回收率为98.71%，RSD为1.15%。

刘青等［15］采用高效液相色谱法等度洗脱，以Kromasil C18柱(4.6×200mm，5um)，流动相为甲醇：0.4%磷酸水(53：47)，检测波长为278nm，柱温室温，供试品溶液制备采用50%甲醇超声提取30min。结果：黄芩苷在0.4ug～2ug范围内呈良好的线性关系r=0.9997；重复性5份供试品溶液黄芩苷峰面积的RSD为1.61%；供试品溶液在10h内稳定；平均回收率为97.65% ，RSD为2.45%。

刘利敏等［5］采用高效液相色谱法二元梯度洗脱，色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(5 um，4.6×250 mm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％磷酸溶液，检测波长：277 nm；柱温为30℃；供试品溶液制备采用70%甲醇超声提取40min。结果：黄芩苷浓度在0.1794～3.5870 ug (r=0.9999) 范围内线性关系良好；重复性6份黄芩苷含量的RSD为0.5%；供试品溶液在40h内稳定；平均加样回收率分别为98.7％。

2.3.2采用间接竞争ELISA法

刘姝晨等［16］采用所建立的黄芩苷间接竞争酶联免疫分析(ELISA) 法检测不同厂家葛根芩连片中黄芩苷的含量差异。利用黄芩苷单克隆抗体, 采用棋盘法以CBS（碳酸盐缓冲液0.05 mol/L，pH 9.6）作为包被缓冲液，包被方式为37℃ 10 min + 4℃，12 h,样品pH值调制于7.4左右，离子强度为0.01 M缓冲体系，竞争反应时间1 h，显色时间15 min 条件下考察线性关系、精密度、加样回收率等方法学指标,建立黄芩苷的间接竞争ELISA 法。结果：建立的黄芩苷间接竞争ELISA 法的线性范围为16.157 ~1280 mg/ L，板间精密度RSD≤9.0%,板内精密度RSD≤5.1%,平均回收率为107.1%，RSD为4.9%。

2.4葛根芩连片中多种活性成分同时测定的方法

邓开英等［4］采用高效液相色谱法，色谱柱ZORBAX Eclipse XDB C18柱(4.6×250 mm，5 um)；流动相以甲醇(A)，0.2％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～12 min，A：B=23：77；12～15min，A：B=23：77～48：52；15～40 min，A：B=48：52)；检测波长250 nm(0～15 min，检测葛根素)和280 nm(1 5～40 min，检测盐酸小檗碱和黄芩苷)；柱温30℃；供试品溶液制备采用70%甲醇水浴加热回流提取30min。结果：葛根素、盐酸小檗碱和黄芩苷分别在0.02～0.40ug（r=0.9999）、0.01～0.20ug（r=0.9999）和0.01～0.20ug（r=0.9999）范围内线性关系良好；平均回收率分别为99.2％、97.1%和97.9％，RSD分别为1.7％、2.1％和1.9%。重复性6份供试品溶液中3种活性成分含量的RSD分别为1.2％、1.4％和1.7%；供试品溶液在12h内稳定。

吴永芹等［6］采用高效液相色谱法梯度洗脱，使用Ultimate LP-C18 (4.6×250 mm, 5um)色谱柱；流动相1%冰醋酸甲醇溶液；检测波长：0～20min，250nm；20～45min，278nm；柱温为35℃；供试品溶液制备采用70%乙醇超声提取30min。结果：葛根素在0.03869～0.7738ug (r=0.99999)范围内，黄芩苷在0.02052～0.4104ug (r=0.99999) 范围内，线性关系良好；葛根素平均回收率为98.57％，RSD为1.6%，黄芩苷平均回收率为99.41％，RSD为1.9%；重复性6份葛根素溶液含量的RSD为0.34%，黄芩苷含量的RSD为0.26%；供试品溶液在24h内稳定；

胡晓茹等［8］采用HPLC法建立特征图谱和含量测定方法，并以液质联用对特征峰进行指认。采用TC-C18色谱柱(4.6×250 mm，5um)，以甲醇为流动相A，以0.15％三氟乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～25min，23％A-30％A；25～26 min，30％A-35％A；26～39 min，35％A-42％A；39～40 min，42％A-45％A；40～55 min，45％A)，检测波长250 nm(用于特征图谱建立和葛根素含量测定)、348 nm(用于盐酸小檗碱含量测定)；采用电喷雾离子源进行正离子模式扫描，对葛根芩连片特征图谱中8个特征峰进行指认。结果：建立了以葛根素和小檗碱为参照峰的葛根芩连片HPLC特征图谱，并指认了葛根素、盐酸小檗碱、3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、葛根素木糖苷、大豆苷、盐酸巴马汀和黄芩苷8个特征峰；葛根素含量在8.8~12.9 mg/片之间，盐酸小檗碱含量在2.5~7.0 mg/片之间；葛根素和盐酸小檗碱分别在0.15～2.90ug（r=0.9999）范围内和0.09～1.80ug（r=0.9999）范围内，呈良好的线性；方法加标平均回收率分别为97.83%～100.2%和97.98%～99.93%，RSD分别为0.5%～1.4%和1.3%～2.6%。重复性6份供试品溶液中葛根素和盐酸小檗碱含量的RSD分别为0.98%和1.0%；供试品溶液在24h内稳定。

李丽莉等［9］采用反相高效液相色谱法，建立葛根芩连片中14个特征性成分的HPLC含量测定方法，以Inertsil ODS-3(250×4.6mm，5um)为色谱柱，以（A）乙腈，（B）0.02mol·L-1 醋酸铵+0.O3%三乙胺溶液(用冰醋酸调pH4.3)为流动相梯度洗脱，葛根素、大豆苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、大豆苷元、甘草酸铵、黄芩素8个成分检测波长250 nm，汉黄芩素检测波长280 nm，表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱5个成分检测波长346 nm；供试品溶液制备采用70%甲醇加热回流30min。结果：葛根素、盐酸小檗碱和黄芩苷分别在146.26～5850.24 ng（r=0.9993）范围内，46.73～1869.25 ng（r=0.9998）范围内，79.18～3167.32 ng（r=0.9996）范围内，呈良好的线性；方法加标平均回收率分别为99.36%、101.32%和100.13%,RSD分别为2.18%、0.77%和1.68%；重复性6份供试品溶液中葛根素、盐酸小檗碱和黄芩苷含量的RSD分别为0.68%、1.75%和1.88%；供试品溶液在23h内稳定。 

3. 总结

（1）文献报道葛根芩连片中葛根的含量测定研究采用了高效液相（HPLC）色谱法和薄层扫描法，传统的薄层色谱采用有机溶剂作为展开剂，一般可得到很好的分离效果，但是有机溶剂有毒、易燃和易挥发等，尤其采用混合溶剂作展开剂时，由于展开剂各组成挥发性的差异，又因提取、点样、及仪器的影响带来误差，从而使实验结果重复性差，但它可快速地进行定性分析的特点可用于葛根素的鉴别，而HPLC法与之相比含量测定准确度更高，重复性更好，样品溶液更稳定性，适合批量产品的检测。

（2）文献报道葛根芩连片中黄连的含量测定研究都采用了高效液相（HPLC）色谱法，可见HPLC法测其有效成分盐酸小檗碱的含量，简便易行，准确度高，重现性好，可为葛根芩连片的质量控制提供有效的技术方法。

（3）文献报道葛根芩连片中黄芩的含量测定研究采用了高效液相色谱法（HPLC）和间接竞争酶联免疫(ELISA)分析法，ELISA法灵敏度较高，便捷、精确、重现性好，但处理样品时间稍长，故可以作为样品的初步筛选与初步评估方法；而HPLC色谱法能达到基线分离，阴性对照无干扰，专属性强、准确度高及自动化的优点，可作为葛根苓连片质量控制的方法。

（4）文献还报道了采用高效液相色谱法同时测定葛根芩连片中多种活性成分的研究，其中采用梯度洗脱和双波长及多波长进行含量检测已成为多数研究者的主要研究范围，同时胡晓茹等［8］和李丽莉等［9］在建立特征图谱的评价系统中提出了以双标峰相对保留时间定位法进行特征峰定位。证明高效液相色谱法建立的特征图谱更能反映样品的真实性，文献说明了中药特征图谱能较为全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量，是评价中药复方制剂整体质量的有效手段。2015版中国药典葛根芩连片中葛根和黄连有效成分的含量测定方法的制定，主要采用了胡晓茹等［8］文献的含量检测方法。

葛根芩连片中的主要药物葛根、黄芩、黄连的代表性成分,葛根素、黄芩苷和盐酸小檗碱含量的波动,可能直接造成该药物临床疗效的不稳定。而中药复方制剂具有多药味多靶点的特点，所以如何建立保证中药复方制剂质量的方法是中药质量控制的关键所在。建立的特征图谱可全面体现葛根芩连片组成成分，简化了标准操作又节省了资源，为葛根芩连片的国家标准的制定提供了参考，为中药特征图谱评价系统提供新的思路。

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