葛根芩连片的含量测定研究进展(二)

葛根是葛根芩连片的君药,葛根素是葛根的活性成份,且含量较高,有许多药理作用,测定葛根素的含量能控制葛根芩莲片的内在质量。谭建生通过实验测定的4批葛根中葛根素含量,不同批次间含量差别较大,含量分布范围在1.4%一5.8%。据此计算,初步认为葛根芩连片中葛根素含量应不低于0.7%。而秦文清的薄层色谱法测定结果也符合这一结果。

三、葛根芩连片中盐酸小檗碱的含量测定实例

盐酸小檗碱为《中国药典》收载品种，含量测定《中国药典》2005 年版二部对其原料药采用容量法，制剂采用高效液相色谱法，有效地控制了该药的质量。

吴永芹等人用HPLC法测定葛根芩连片中盐酸小檗碱的含量。实验的条件是色谱柱: Diamonsil C18,流动相:乙腈-5mmol/L十二烷基硫酸钠溶液(冰乙酸调pH 4.0)(52:48),流速:1.0mL/min,检测波长:348nm,理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4500。盐酸小檗碱在0.1008-2.52μg范围内线性关系良好(R=1.000);平均加样回收率(n= 9)为101. 2%。在这次试验中研究员取供试品溶液进样,经二极管阵列检测器检测后,对样品中盐酸小檗碱色谱峰进行单一性验证,各值为961.5、999.8、998.6、999.2、971.0,均高于其阈值428.0，并将其在线紫外吸收光谱与对照品光谱比较,二者相同,表明盐酸小檗碱色谱峰纯度高,为单一峰,符合含量测定的要求。

江汉美等采用反相高效液相色谱法,用AgilentZORBAX SB-C18柱(4.6× 250mm,5μm),以乙腈-0.05mol/L三乙胺溶液(用磷酸调节pH至3.0)(25：75)为流动相,流速为1.0mL/min,检测波长为347nm,柱温为室温。RP-HPLC法测定方中盐酸小檗碱的含量在0.16-0.80μg范围内线形关系良好,r=0.9993,平均加样回收率为97.0%,RSD=1.3%。

四、葛根芩连片中黄芩苷的含量测定实例

葛根芩连片以葛根芩连汤为基础配方制作，方出于张仲景《伤寒论》。原方为里热挟表邪下利而设，由葛根、黄芩、黄连、甘草四味药组成，葛根升津兼解肌发表，黄芩、黄连清热止利，甘草和中缓急，是清热止利，兼以解表的代表方。黄芩在其中的重要性不言而喻，黄芩苷作为黄芩的主要活性成分，其含量多少对于葛根芩连片的药效有重要意义。

（一）间接竞争酶联免疫分析(ELISA)法

刘姝晨等人利用黄芩苷单克隆抗体，通过考察线性关系、精密度、加样回收率等方法学指标，建立黄芩苷的间接竞争 ELISA 法，并用所建立的方法测定7个不同厂家葛根芩连片中黄芩苷的含量。试验中研究人员对黄芩苷间接竞争 ELISA 法进行了系列的方法学考察，结果表明以 CBS 缓冲液作为包被缓冲液，包被方式为37℃10 min＋4℃12 h，样品pH值调制于 7．4 左右，离子强度为0．01 M 缓冲体系，竞争反应时间1 h，显色时间15 min 条件下的灵敏度最佳。由此实验可得建立的黄芩苷间接竞争 ELISA 法的线性范围为16.157-1280mg/L，板间精密度RSD≤9．0%，板内精密度RSD≤5．1%，平均回收率为107．1% ( RSD=4．9%)。

含量测定结果显示，7个厂家生产的葛根芩连片中黄芩苷含量从4．45 mg/片到 13．41 mg /片不等，差距较大，所得结果与相关 HPLC 检测结果相符。

（二）高效液相色谱法

刘青、赵敏采用高效液相色谱法。在Kromasil C18柱(4.6mm×200mm,5μm),流动相为甲醇-0.4%磷酸水(53∶47),流速为1mL /min,检测波长为278nm的色谱条件下黄芩苷在0.4μg-2μg范围内呈良好的线性关系,R=0.9997,平均回收率为97.65%, RSD为2.45%(n= 5)。

王小龙的实验中用KromaslC18色谱柱(4.6×250mm,5μm);流动相为甲醇-水-磷酸(50:50:0.2);检测波长为276nm;柱温是30`C;流速为2.0ml/min;进样量:20μl;检测波长为276nm。实验结果如下线性范围为0.16-1.88μg(R=0.9998),平均回收率为98.71%。此次实验的优点有以下3点：样品的处理简单易行,50%甲醇溶液直接超声30min,过滤,可作为提取方法；经比较甲醇-水-冰醋酸的分离效果,实验所采用的流动相分离效果好,保留时间适宜；经比较用70%乙醇及流动相溶液,实验所采用的50%甲醇溶液对样品的提取更有利于有效成分的充分提取。

五、总结

近年来，随着对中药复方制剂质量标准研究的不断深入，医药工作者越来越意识到中药复方制剂的功效是药品内含成分整体作用的体现，是多种成分、多种机制的综合作用的结果，仅仅凭借以某一化学成分为对照的定性和定量的中药质量控制方法，不能真正反映中药的内在综合质量，因此提出了中药整体控制模式。从文献的数据中发现，葛根芩连片中所含的成分各厂家差异显著。究其原因除制剂过程中工艺控制的差异导致各企业产品差异外，也是目前中药材的来源非常复杂，参差不齐，中药材科属不同、环境不同以及栽培、采收加工方式不同且品种繁多所致。葛根芩连片质量控制基本都采用薄层色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、紫外分光光度法等方法测定有效成分（指标性成分）。在对葛根芩连片几种主要组成成分含量测定方法研究进展分析中可知，由于HPLC法具有较高的分离效率和较快的分析速度，最适宜复方制剂，适用于成分复杂的多组分制剂，因此使用更为广泛。在查找文献资料过程中，我发现在中药成分复杂、多环节、多靶点的作用模式下，运用各种试验方法对葛根芩连片中的多种有效成分进行同时含量测定正在逐渐成为主流。而HPLC仍旧是应用最多的技术。其次新兴的一些含量测定方法例如气相色谱法、毛细管电泳法和一些联用技术（如GC-MS、HPLC-MS、CE-MS等）由于可找到的文献资料不足未在文中举例。

参考文献

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