山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 (6)(二)

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（三）标准曲线的绘制

标准曲线的绘制精密，吸取芦丁标准溶液0. 0, 2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10.0 mL,分别置于25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀后放置6m irk加100 o硝酸铝溶液1 mI,摇匀后再放置6min加400氢氧化钠溶液10 mI,再加60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min在最大吸收峰510 rm波长处测吸光度，结果见表1。用最小二乘法作线性回归，得芦丁浓度与吸光度的标准曲线方程:A--12. 2875C -0. 014667,相关系数=0. 99950。

表1 不同芦丁浓度的吸光度值

浓度/(mg1mL-1) 0.016 0.032 0.048 0.064 0.080

吸光度 0.179 0.367 0.560 0.775 0.980

四、实验结果分析

（一）山楂总黄酮纯化条件的选择

聚酞胺柱层析法分离效果好，样品容量大，适于在制备分离工艺中应用。但洗脱速度慢，死吸附较大损失有时高达30 %)，常有低分子量酞胺的低聚物杂质混入，装柱时用5%甲醇或10 %盐酸预洗除去低聚物。李文魁等以甲醇一氯仿为洗脱剂，用聚酞胺层析柱对各种黄酮贰类进行分离，效果好。高木修造等利用硅胶层析柱氯仿-甲醇作洗脱剂和聚酞胺层析枚水一甲醇作洗脱剂)配合分离，从黄答中分离出11种黄酮类化合物;利用聚酞胺层析柱，水和乙醇梯度洗脱，从金钱草中分离到5种黄酮类化合物。

由于黄酮类化合物与硅胶有很强的吸附能力，难洗脱，而且与硅胶中很多金属离子络合而不能被洗脱.所以应预先用浓盐酸处理硅胶除去金属离子.以免干扰分离效果。硅胶主要用于分离极性较低的黄酮类化合物如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮醇)和高度甲基化或乙酞化的黄酮和黄酮醇，如用乙醚一氯仿溶剂系统从野靛中分离异黄酮类硅胶在降活后也可用于极性较大的黄酮类化合物，如贰类、多轻基黄酮类化合物。如穿心莲根丙酮提取物用苯一己炕，洗脱得到二甲醚，用苯洗脱得到5-0H-7. 8. 2'-四甲氧基黄酮醇。

（二）最大吸收波长

吸取一定量的标准溶液和样品溶液，分别置于两支10 mL比色管中，加60%乙醇至5 mI,按L 24 2方法显色，以等量的60%乙醇作空白，显色后，标准溶液和样品溶液分别于400 ~ 600 rrn扫描，确定其最大吸收波长。

芦丁标准溶液(1)和样品溶液(2)显色后在400 ~600 rrn扫描，得最大吸收峰分别为510 nm和500 rrn。由于样品溶液在510 rrn和500 nm波长处的吸光度差小于0 002 AU故将510 nm确定为测定波长。光谱扫描曲线见图1.

图1 光谱扫描图

（三）标准曲线的绘制

精确移取上述芦丁的标准溶液液o. 1. o. 2 0.3 0, 4 0, 5 0 mL分别置于6只10 mL比色管中，用60%乙醇补足SmL加50 o N aN02溶液0 3 mI,摇匀，再加100o A1(N03):溶液0 3 mI,摇匀，放置3m in,加1 mol/LN}H溶液4 mL和水0 4 mI,摇匀，放置10 m in,以60%乙醇水溶液为空白，于510fIn处测定吸光值，以吸光度值(A)对山碴黄酮含量(C, mg fnL)作回归曲线，得回归方程。

（四）比色条件的优化

加入N aN02溶液放置时间的选择。准确吸取标准溶液和样品溶液各2 mL于具塞试管中，加入5 0 o N aN0:溶液0 3 mI,摇匀，分别放置0, 2, 3, 6 m in,其他

条件不变，测定结果见表2.

加入A1}N03 }3溶液放置时间选择。准确吸取标准溶液和样品溶液2 mL于具塞试管中，加入50o NaNO:溶液0 3 mI,摇匀，立刻加入100 o A 1(N03):溶液0 3 mI,摇匀，分别放置0, 3, 4,6min,再加1 m o 1 /L N a0H溶液，测定结果见表3。

由表3可以看出，加入AI}N}3 }3溶液后的放置时间对实验结果有一定影响，可能是铝离子和黄酮化合物形成配合物需要一定时间才能达到稳定。实验结果表明，加入AI（NO3）O3溶液放置3 m in后，加入N a0H溶液，结果准确可靠。

（五）方法学考察

5.1精密度考察

精密吸取5份2 mL标准溶液，分别放入10 mL比色管中，按L 2 4 2的方法测定吸光度，计算RSD值。结果表明，相对标准偏差RSD仅为0 580，精密度良好。5.2显色稳定性考察

精确吸取标准品和样品溶液各2 mL于10 mL比色管中，按L 2 4 2的方法测定吸光度。当显色体系反应完全后，每隔5 m in记录一次吸光度值，连续30 m in考察两者稳定性。在30min内，标准品溶液吸光度保持不变，样品溶液吸光度变化不大，所以选择显色体系反应完全后30min内测定其吸光度。

5.3 重现性考察

精确称取Sg干山碴5份，按1 2 1方法提取和122确定的最佳条件纯化后，得5份样品溶液，各取2 mI,按1 2 4 2方法测定吸光度，代入回归方程计算山碴总黄酮含量。

5.4加样回收率考察

分3组，每组做3份平行样，均取1 mL样品溶液于具塞试管中，分别再加入一定量芦丁标准溶液，按L 2 4 2方法测定吸光度，计算其加样回收率。

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