山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 (6)(一)

山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 

目         录

一、引言·······················································2

二、实验材料··················································2

三、实验过程··················································2

（一）黄酮的提取·············································2

（二）黄酮的纯化·············································3

（三）标准曲线的绘制········································4

四、实验结果分析·············································4

（一）山楂总黄酮纯化条件的选择···························4

（二）最大吸收波长···········································4

（三）标准曲线的绘制········································5

（四）比色条件的优化········································5

（五）方法学考察··············································6

（六）样品测定·················································6

五、结论分析····················································7

参考文献···························································7

一、引言

山楂，可食用植物，仁果类水果，质硬，果肉薄，味微酸涩。 落叶灌木。枝密生，有细刺，幼枝有柔毛。小枝紫褐色，老枝灰褐色。能防治心血管疾病，在中草药中的应用历史悠久，作为营养滋补产品备受青睐，也是大多数复合饮料的原材料，山楂含有丰富的营养成分及活性物质，主要包括β一胡萝卜素、维生素、氨基酸和黄酮类化合物等。

本实验采用标准曲线法测定南山植中总黄酮含量的方法，结果表明该方法灵敏度高，专属性强，操作简便，重现性好。

本文简要介绍了山楂中黄酮类化合物的测定方法，重点对山楂中黄酮类化合物的提取方法进行综述，旨在为山楂在饮料工业中的综合利用提供参考。

二、实验材料

1%三氯化铝溶液；753紫外分光光度计；电热恒温水浴锅；芦丁标准溶液；氢氧化钠溶液10 mI,。

三、 实验过程

（一） 黄酮的提取

新鲜山碴去核、切片，晒干，制成干山碴备用。

准确称取5g干山碴置于圆底烧瓶中，加入100mL 80%乙醇水溶液(v W)，于70℃回流提取1b重复1次，合并提取液，真空浓缩至无醇味(约20mL)，加无水乙醇定容至50 mI,摇匀，备用。

芦丁标准溶液配制精密称取120℃下干燥至恒重的芦丁标准品50 mg置于250 mL容量瓶中，加60%乙醇20 mL使之溶解。再加入60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液，每1 mL中含无水芦丁0. 20 m g称取试验样品，用80m1沸水冲泡5次，每次冲泡10min 。设置冲泡水量与浸提时间两大因子，称取试验样品1. 0g若干份，分别用20.40.60.80.100m1沸水冲泡，置于95℃的电热恒温水浴锅中分别浸提20.30.40.50.60min。

水提法。水提法适于黄酮贰类物质提取。该法成本低、对环境及人类无毒害、设备简单，适合工业化大生产，但提取率低，提取物中杂质较象如无机盐、蛋白质、糖类等)，后续分离麻烦，现在很少单一使用该法。胡敏等对水提法作了改进，使所得银杏提取物GBE中总黄酮的含量有所提高。

碱性水或碱性稀醇提取法。黄酮类化合物大多具有酚轻基，易溶于碱水，酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黄酮酚轻基的酸性，二是由于黄酮母核在碱性条件下开环，形成2'-轻基查耳酮，极性增大而溶解。因此可用碱性水将碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液)或碱性稀酸50%乙醇)浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多，不利于纯化。含有较多的果胶、勤液质、靴质及水溶性杂质但浸出效果不如氢氧化钠水溶液好，同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质被滤除。一般可以根据不同的原料使用不同碱性溶液。等用pH值为10的氢氧化钠溶液从菊花中提取黄酮类物质时，效果较好。曹永刚用碱性较强的饱和石灰水从魁米中提取芦丁，使芦丁成盐溶解，效果好日。一般应注意酸碱性不宜过强，以免强碱在加热时破坏黄酮，也防止在酸化时生成盐，使析出的黄酮又复分解.影响收得率。

提取时也宜采用石灰水，使它们与氢氧化钙生成钙盐沉淀滤除。

（二）黄酮的纯化

分别过滤，滤液定容至100m1备用。吸取试液(试液的制备文稿中己介绍)0. Sml，加1%三氯化铝溶液9. 5ml，摇匀，静置显色10min，以试剂空白作参比，用10mm比色皿，于波长420nm测定光密度E。2.1.1聚酞胺柱层析法。

聚酞胺柱层析法分离效果好，样品容量大，适于在制备分离工艺中应用。但洗脱速度慢，死吸附较大损失有时高达30 %)，常有低分子量酞胺的低聚物杂质混入，装柱时用5%甲醇或10 %盐酸预洗除去低聚物。李文魁等以甲醇一氯仿为洗脱剂，用聚酞胺层析柱对各种黄酮贰类进行分离，效果好。利用硅胶层析柱氯仿一甲醇作洗脱剂)和聚酞胺层析枚水一甲醇作洗脱剂)配合分离，从黄答中分离出11种黄酮类化合物;利用聚酞胺层析柱，水和乙醇梯度洗脱，从金钱草中分离到5种黄酮类化合物。2.1.2硅胶柱层析法。由于黄酮类化合物与硅胶有很强的吸附能力，难洗脱，而且与硅胶中很多金属离子络合而不能被洗脱.所以应预先用浓盐酸处理硅胶除去金属离子，以免干扰分离效果。硅胶主要用于分离极性较低的黄酮类化合物如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮醇)和高度甲基化或乙酞化的黄酮和黄酮醇，如用乙醚一氯仿溶剂系统从野靛中分离异黄酮类硅胶在降活后也可用于极性较大的黄酮类化合物，如贰类、多轻基黄酮类化合物。如穿心莲根丙酮提取物用苯一己炕洗脱得到芹菜素7，4气二甲醚，用苯洗脱得到5-0H-7, 8, 2'-四甲氧基黄酮醇。  

葡聚糖凝胶柱层析法。葡聚糖凝胶主要有SephadexLH-2。型和Sephadex-G型)是一种淋洗速度快，可以反复使用，没有损失的非常好的分离和纯化黄酮类化合物的填充材料。其中Sephadex-LH20的洗出液中不含杂质，适用于从纸色谱分析、硅胶及聚酞胺柱色谱中分离出来的黄酮类化合物糖贰配基及糖贰的最终纯化。葡聚糖凝胶在分离游离黄酮时，主要靠吸附作用，吸附程度取决于游离酚轻基的数口，游离酚轻基的数口越多越难以洗脱;在分离黄酮贰时，则分子筛的属性起主导作用，相对分子质量的大小或含糖的多少决定化合物被洗脱的先后，分子量越大，连的糖越多，越易洗脱。如用甲醇作洗脱剂，从SephadexLH -20柱洗出下列物质先后顺序为:刺槐成山蔡酚-3一半鼠李糖一鼠李糖贰)、芦双双糖)、棚皮成单糖)、芹菜索5, 7, 4'-三轻基黄酮)、山蔡酸3, 5, 7, 4'-四轻基黄酮)、棚皮索3, 5, 7, 3',4'-五轻基黄酮。用葡聚糖凝胶柱层析从密蒙花中分离得到了8个黄酮类化合物。