大鼠血浆中华法林的药物动力学研究(二)

二 材料与方法

（一） 试剂与仪器

1 药品与试剂

   华法林钠标准品（纯度＞99.5%），华法林钠上海信谊药厂有限公司，（2.5mg/片），复方血栓通胶囊（广东众生药业股份有限公司，0.5g/粒），甲醇、乙腈、乙酸铵、冰乙酸（均购于杭州米克化工有限公司）。

2 实验动物

   从上海斯莱克实验动物有限公司购买的SPF级SD雄性大鼠（体重200±20g），许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

3 实验仪器

   高效液相色谱系统：岛津LC-20ATvp高效液相色谱仪；岛津SPD-20Avp紫外-可见检测器；大连依利特 BDS C18 column (5μm, 150 mm×4.6 mm)色谱柱；保护柱BDS C18 Precolumn (4.6 mm×12.5 mm)保护柱；分析软件浙江智达N2000色谱工作站；T&D SCD-15柱温箱；德国Hettich 台式高速冷冻离心机，莱比信(中国)科技发展有限公司；DN系列氮气吹干仪，广州科栢实验器材有限公司；XM-80A漩涡混合器；汉密尔顿微量进样器 25μL，水浴锅；分析天平；烧杯；量筒；容量瓶；移液管；灌胃针。

（二） 试验方法

1 色谱分析方法

   日本岛津shimadzu 20AT高效液相色谱系统，智达N2000色谱工作站，流动相将甲醇和pH2.8的0.05Mol/L的-醋酸铵溶液以体积比70:30的比例配置而成，配置完成之后，使用超声波进行除汽包。流动相的洗脱速率是1.0 mL/min，柱子温度控制在35℃，紫外检测设定波长为308nm，采用外标法定量对华法林进行定量（华法林钠标准品作为标准物）。

2 血浆样品的处理与制备

   准确的量取0.1ml血浆于1.5 mL具有塞子的离心管中，并加入0.1mL的色谱乙腈，对称的放入漩涡混合器使血浆与色谱乙腈混合均匀，放入高速冷冻离心机12000 r/min高速离心5 min后，用移液枪轻轻的吸取上清液，0.22μm滤膜过滤后，用微量进样器吸取20 μL上清液进高效液相色谱系统分析。

3 标准曲线制备

   准确称取华法林钠标准品10.0mg ,小心倒入100.0mL容量瓶，加入流动相小心的冲洗杯壁以确保华法林钠标准品全部溶解并定容至 100.0 ml ,作为储备液使用，将储备液用流动相分别进行稀释1、2、10、20、100、200、1000倍，制成100.0，50.0，10.0，5.0，1.0，0.5,0.1μg/mL系列华法林纳标准液，具有塞子的离心管中各加入0.9mL上述标准液，再加入空白血浆每管0.9mL，用漩涡混合器混匀后，12000 r/min高速离心5 min，用移液枪小心吸取上清液，0.22μm滤膜过滤后，进样器吸取20 μL进上清液高效液相色谱系统分析。流动相为甲醇：0.05M醋酸铵溶液（pH2.8）=70：30（v/v），设置洗脱液流速1.0 mL/min、柱温35℃、紫外检测波长308nm。将进样分析得到的药物峰面积（Y）为纵坐标，以药物浓度（X）为横坐标进行线性回归。

4 方法回收率和精密度

   利用之前的华法林纳储备液制备含药物浓度在曲线范围内的高、中、低浓度血浆样品0.1，1，10 μg/mL作为质控样品（QC），12000 r/min高速离心5 min后，吸取上清液，0.22μm滤膜过滤后，吸取20 μL上清液进高效液相色谱系统分析，每个浓度样品重复预处理和进样分析5次，以样品中药物峰面积与未经处理相同浓度的标准液的峰面积之比，计算高、中、低3种浓度下华法林监测方法的回收率。取上述高中低浓度的样品在一天不同时间点内重复预处理和5次进样，比较每次药物峰面积的变化情况，计算幅度得出日内变异系数，再取上述高中低浓度样品分别连续五天重复进样，比较五天药品峰面积的变化并计算出日间变异系数。

5药物动力学研究

   实验动物: 144只SPF级SD实验大鼠（体重200±20g）[19]。 实验器材: 100 ml容量瓶两只和250ml容量瓶一只, 玻璃棒，烧杯若干，大鼠灌胃针若干只。 实验药品: 华法林钠片(2. 5 mg/片, 上海信谊药业有限公司) , 复方血栓通胶囊（0.5g/粒，广东众生药业股份有限公司），蒸馏水。144只SPF级SD实验大鼠，正常进食、进水、饲养环境温度（26．5 ±0．5)℃、正常光照，随机分为华法林给药组和华法林+血栓通给药组，进行实验适应性饲养三天。取4片华法林纳溶解在250ml蒸馏水中，制成0.04mg/ml的华法林纳溶液待用。取30颗复方血栓通胶囊，拆开胶囊倒出药物，使其溶解在100ml华法林纳溶液制成华法林钠0.04mg/ml+血栓通0.15mg/ml的混合溶液待用。分别以华法林钠0.2mg/kg，华法林钠0.2mg/kg+血栓通0.75g/kg，口灌给药，于给药后0，0.17，0.5，1.0，3.0 , 5.0, 12.0, 24.0, 48.0, 72.0, 96.0，120.0h每组6只大鼠腹主动脉采血法，分离血浆，按照上述血浆样品处理方法进行处理，进样分析，将求得的峰面积代入相应的标准曲线，计算出血浆中药物浓度，绘制药物浓度——时间曲线方程，调试3P97药物动力学软件并利用其计算大鼠口灌华法林后的药物动力学参数。

三 结果

（一） 色谱图及特异性分析

血清中华法林的色谱图：

                            图 3.1  标准液色谱图

 

图 3.2  空白血清色谱图