缺血性脑卒中的分子机制研究进展(四)

CADASIL：伴皮质下梗死和脑白质病的常染色体显性遗传性脑动脉病；HERNS：伴视网膜病、肾病、卒中的遗传性内皮细胞病；SCD：镰状细胞病；MELAS：线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作。1996 年，Rubattu 等最早通过对易卒中型自发性高血压大鼠进行研究证明，3 个与心房和脑利钠肽基因连锁的数量性状遗传位点 -STR1～3 是独立于原发性高血压因素之外的复杂型卒中的遗传致病因素。2007 年，Matarin 等首次利用 GWAS 研究检测缺血性卒中的易感基因，尽管未发现任何单个区域与缺血性卒中明显相关，但仍筛选出一些有意义的 SNP，且它们大多定位于已知热点候选基因位点或邻近位点。随后，Bersano 等对众多已知缺血性卒中候选基因进行评估发现，编码因子 V、因子Ⅱ、ApoE、纤溶酶原激活抑制物 -1、血小板受体 GPIBA、ACE 和亚甲基四氢叶酸还原酶的基因与卒中风险显著相关。此外，Meschia 等还在缺血性卒中同胞研究中发现，患病组染色体 3p 和 6p 处有 SNP 聚集，包括一氧化氮合酶基因，且与卒中发病年龄有关，提示一氧化氮合酶基因多态性参与了缺血性卒中的发病。这些结果表明，影响缺血性卒中的遗传易感基因的数量和频率在群体水平分布十分广泛。值得注意的是，这些基因主要与肾素一血管紧张素 - 醛固酮系统、凝固和止血、炎症、同型半胱氨酸代谢、脂代谢、内皮细胞功能和细胞外基质功能等有关。缺血性卒中基因组学研究取得的重大进步是在冰岛人群的家系研究中发现了染色体 5q12 区域的磷酸二酯酶 4D（phosphodiesterase 4D，PDE4D）基因突变与缺血性卒中相关。PDE4D 属于降解环磷酸苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的磷酸二酯酶超家族。cAMP 在平滑肌细胞和巨噬细胞的增殖中起着重要作用，参与动脉粥样硬化形成，并影响斑块稳定性。目前，PDE4D 基因多态性在缺血性卒中发病中的分子机制尚不清楚。不过，研究显示，我国汉族人群 PDE4D（83T/C）CC 基因型和 C 等位基因与缺血性卒中的发病风险增高有关。Nilsson-Ardnor 等对曾被用来进行过 PDE4D 重复性研究的遗传变异较低的家系进行研究发现，除位于染色体 5q 的卒中易感位点之外，还存在许多易感性较低的卒中遗传位点。还有研究显示，位于染色体 13 q12 区域的 5- 脂氧合酶激活蛋白（5-lipoxygenase activating protein，ALOX5AP）基因是诱发卒中和心肌缺血的易感位点，而且一个常见 SNP（rs17222919）使中国东部人群缺血性卒中风险增高 1.34 倍，在小动脉闭塞性卒中和女性中更为显著。ALOX5AP 参与白三烯通路，一直被认为是动脉粥样硬化的危险因素，提示 ALOX5AP 可能通过增强炎症反应和加速动脉粥样硬化来促进卒中发生。此外，其他白三烯通路的基因变异体，如白三烯 A4 水解酶和白三烯 B4 受体 BLT1 和 BLT2 区域也可能与卒中相关。

另外，许多研究显示，缺血性卒中各亚型的致病基因存在差异。Debette 等的研究显示，SNP（rs2208454）与无卒中发作史的原因不明性梗死有关，其位于染色体 20p12 区域 MACRO 结构域的 3 号内含子，包括 2 个位于纤连蛋白富有亮氨酸跨膜蛋白 3 基因（fibronection leucine-rich transmembrane protein 3 gene，FLRTP3）的下游区域基因。Kubo 等的研究显示，一个蛋白激酶 C 家族的 SNP——PRKCH 与腔隙性梗死风险显著相关。Ikram 等的研究显示，位于染色体 12p13 区域靠近 NINJ2 和 WNK1 基因的 2 个常见 SNP 与局部缺血，尤其是动脉粥样硬化性卒中相关。Gretarsdottir 等的研究显示，位于染色体 4q25 区域的转录激活子 PITX2 基因附近有 2 个相邻的 SNP 与心源性脑栓塞显著相关。此外，Gudbjartsson 等还发现，位于染色体 16q22 区域编码同源结构域锌指蛋白的 ZFHX3 基因也与心源性脑栓塞有关。由于 PITX2 和 ZFHX3 基因被认为是心房颤动的危险因素，因此这 2 项研究结果提示，某些与心血管病相关的基因突变是心源性脑栓塞的危险因素。另有研究显示，9 号染色体突变与心肌梗死和冠状动脉疾病相关。Anderson 等的进一步研究显示，9p21 区域的 CDNK2A 和 CDNK2B 基因与大动脉粥样硬化性卒中有关。如果靶向敲除小鼠 4 号染色体上的同源性 70 kD 非编码间隔，其附近的心脏和血管细胞的基因特性可发生改变，表明 9p21 区域在调节心脏 CDKN2A/B 表达和影响冠心病和缺血性卒中进展方面起着关键作用。

目前，多基因遗传缺血性卒中的结构基因组学和功能基因组学研究正在如火如荼地展开。拷贝数变异（copy number variants，CNV）属于结构基因组学范畴，指长片段 DNA（＞1 000 bp）的重复和缺失，进而导致基因贮积、结构改变或截短，最终影响基因功能。Matarin 等采用基于高密度 SNP 分析对 263 例缺血性卒中患者和 275 名正常对照者进行研究发现了 247 个 CNV，包括 187 个插入突变和 60 个缺失突变，提示 CNV 能增高缺血性卒中的发病风险。CNV 等基因突变还能引起转录和蛋白表达水平的改变，进而影响疾病的表型。Mitsios 等在卒中发病后 2～6 d、9～20 d 和 26～37 d 分别建立了 3 个 mRNA、表达谱，分别发现 77、92 和 15 个基因在卒中患处表达下调，表明基因表达会随着卒中进程而出现动态性改变，并首次发现 3 个基因（PAK1、MMP11 和 INI1）与卒中显著相关。Liu 等还对大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后微小 RNA（microRNA，miRNA）变化水平进行了研究，结果显示，一组 miRNA（mo-miR-140、mo-miR-143、mo-m1R-204 等）发生双向表达改变，从而导致急性损伤和恢复延迟，提示 miRNA 水平改变也与缺血性卒中有关。此外，有研究提示，增加雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）启动子甲基化在动脉粥样硬化和血管老化中起着作用。Lee 等 [38] 的研究显示，MCAO 能使 Na+-K+-2Cl- 共转运体 1（Na+-K+-2Cl-co-transporter type 1，NKCC1）基因启动子甲基化减少，从而导致 NKCC1 表达上调，继而引起神经元损伤，表明 DNA 甲基化可能参与了缺血性卒中的病理学过程。这些结果提示，DNA 甲基化、组蛋白转录后修饰和高位染色体重塑等在缺血性卒中的进展和易感性中起着重要作用。

除缺血性卒中的易感基因研究外，药物基因组学和影响卒中预后的基因组学研究也取得了一定的进展。氯吡格雷能降低缺血性卒中的复发风险，细胞色素 P450 酶（cytochrome P-450，CYP）能将其转化为活性代谢产物。CYP2C19 等位基因功能降低可使卒中发病风险增高 53%。此外，Westbroek 等的研究证实，脑源性神经营养因子基因（va166met）多态性与运动诱发电位波幅增加较小和运动皮质分布重组有关，va166met 突变预示卒中患者预后较差。这些研究将为临床医生进行个性化治疗提供帮助。

2.4.存在的问题与展望

虽然缺血性卒中的基因组学研究发展迅猛，但仍任重而道远，主要原因可能包括：（1）起病较晚，难以收集到大的家系；（2）不同种族、不同人群、不同发病年龄及不同表型的发病机制可能不同；（3）不同的基因突变可能导致同样的表型或一些继承了易感等位基因的个体没有发病或一些没有继承易感等位基因的个体由于随机或环境原因仍出现缺血性卒中，以致发病机制非常复杂；（4）并存高血压、冠心病、糖尿病等混杂因素，易感基因可能直接或间接与环境暴露因素相互作用，导致单个基因的作用很难估计；（5）常见的基因突变本身不引起卒中易感性增高，每个基因对整个遗传的影响很小，并且样本量小，统计效能不足，因此只能检测常见的 SNP，而检测不到罕见的 SNP，很多结果为假阳性；（6）临床诊断不确切，缺乏血液学诊断指标，不同样本分层的研究结果可能不一致。因此，至今仍很难明确任何 1 个或多个缺血性卒中的致病基因。

将来，研究人员首先要对缺血性卒中进行正确的分型，进行严格的病例对照匹配，以使非研究因素在病例组和对照组之间甚至不同人群间尽可能一致，如可通过“表型组学”改善卒中表型的宽度和辨别，降低临床异质性等。此外，多个研究中心的合作将有利于获得足够大的样本量和统计效能，从而保证基因组学研究结果的可靠性。危险因素评分也可能对预测卒中有用。我们相信，随着大量创新性分子生物学技术和生物信息学技术的出现，以及卒中分型准确性的提高、全球范围内多中心和大样本临床合作等，基因组学研究有可能最终帮助我们寻找到对缺血性卒中的诊断、治疗和评估具有重要价值的生物学标记物。[03]